induced apoptosis in human neuroblastoma cells.Overexpression of TF might contribute to chemotherapy resistance in neuroblastoma and its progression,at lest in part,by regulating doxorubicininduced apoptosis.Key words: Tissue factor; Neuroblastoma; Apoptosis; Chemotherapy
组织因子(tissue factor,TF)是外源性凝血途径的启动因子，内皮细胞和单核细胞TF表达及活性的增强与血栓栓塞性疾病密切相关。然而，TF在多种肿瘤如乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、神经母细胞瘤等表达异常增高，其表达水平与肿瘤分化程度等病理特征相关，与预后呈负相关[1,2]。近年来研究发现TF具有信号转导受体的功能，可通过诱导多种信号转导增强肿瘤的生长、侵袭及转移[3]。TF影响肿瘤发生发展的机制目前并未完全阐明。TF是否参与化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡，影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性尚无报道。本文通过基因转染研究了TF在人神经母细胞瘤中的高表达对阿霉素诱导肿瘤凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞系与试剂 人神经母细胞瘤细胞系SKNSH及SHEP1由美国Muxiang Zhou教授惠赠(Emory University,Atlanta,USA)，在含10%胎牛血清、2 mMLglutamine,50 u/ml青霉素及50 μg/ml链霉素的RPMI 1640中，37℃、5%CO2环境下培养。鼠抗人TF单抗(TF910H10)购自Calbiochem(San Diego,CA),鼠抗人caspase3及βactin单抗购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA),鼠抗人PARP单抗购自BD Biosciences(San Jose,CA)。
1.2 质粒及基因转染 采用作者既往构建的含有TF全长cDNA的真核表达载体TFpcDNA 3[4]。SKNSH细胞以1×106/孔密度接种于6孔培养板，24 h后以Lipofectamine 2000TM(Invitrogen,CA,USA)介质进行瞬间转染，每孔转入质粒2 μg;以空载体pcDNA 3作为对照，48 h后收获细胞用于检测蛋白表达或阿霉素诱导凋亡相关实验。
1.3 Western印迹法 收集细胞后，以细胞裂解液处理，离心后取上清，以考马斯亮蓝法(Protein assay,BioRad,美国)进行蛋白质定量。蛋白变性后，以含有10 μg总质白的样本进行10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后将凝胶上的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上，封闭液封闭后，分别以特异性TF、Caspase3、PARP或βactin单抗孵育，4℃过夜，继而与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，以增强化学发光法(ECL,Amersham Life Science,英国)显色。以βactin作为蛋白质完整性及等量的对照。
1.4 细胞毒性试验(WST法) 阿霉素对人神经母细胞瘤细胞系的细胞毒性以WST(watersoluble tetrazolium salt)法检测，原理与MTT法相同，以水溶性四唑盐WST1(Roche,德国)替代MTT,WST1被具有代谢活性的细胞中的线粒体相关脱氢酶裂解，产生的有色产物可直接在分光光度计上检测，其浓度与细胞活性成正比，而不需加入二甲亚砜溶解MTT法产生的难溶性的蓝色结晶物，因此操作更简便，结果更稳定[5]。将胶质瘤细胞以5×104/孔密度接种于96孔培养板，与不同浓度的阿霉素孵育44 h，之后每孔加入WST1试剂25 μg，37℃继续孵育4 h后，450 nm波长测定光密度(optical density,OD)，参考波长为620 nm。
1.5 细胞凋亡检测 经过处理的细胞以10 μM Hoechst 33342(invitrogen,CA)于37℃染色1 h，而后在倒置荧光显微镜(Olympus IX50)下观察。由不了解本研究的观察者计数凋亡细胞数，共完成3次独立实验，每个实验中每次处理条件下从3个培养孔中随机选择视野(200×)计数。
1.6 统计学处理 上述实验中每种处理均重复进行3次，部分结果以均数±标准差表示。选用t检验法进行统计学处理，以P<0.05作为有统计学显著性差异
上一页 [1] [2] [3] [4] 下一页
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 内科论文 >> 正文