融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化
GST和VEGFD的VHD片段的蛋白分子量分别为26 kD和12 kD，GSTVEGFD的分子量理论值应为38 kD。SDSPAGE分析含pGEX5X1/VEGFD的大肠杆菌BL21(DE3)的蛋白表明，融合蛋白分子量与预期结果一致，为38 kD左右。表达产物主要以包涵体的形式存在(图3)。
Figure 3. Expression and identification of GSTVEGFD fusion by SDS PAGE.Lane 1: protein molecular weight standard. Lane 2: E.coli BL21 control. Lane 3: GST control. Lane 4: supernatant of GSTVEGFD. Lane 5: precipitation of GSTVEGFD. 以牛血清白蛋白为标准蛋白，将电泳后凝胶中经考马斯亮蓝染色得到的蛋白带用GelPro软件分析，GSTVEGFD融合蛋白占细菌总蛋白的15 %。
对超声后的细菌蛋白用含1% Triton X100的PBS溶解之后，经GST亲合层析柱纯化，然后收集洗脱组分，再经透析除去谷胱甘肽。SDSPAGE检测蛋白的纯度，结果如图4所示。可见在纯化的组分中含有部分融合蛋白降解后形成的GST。
Figure 4. Identification of purified GSTVEGFD by SDS PAGE.Lane 1: protein molecular weight standard. Lane 2. GST control. Lane 3: supernatant of GSTVEGFD. Lane 4: purified recombinant protein of GSTVEGFD.
融合蛋白的Western blot分析
分别用抗GST抗体和抗VEGFD单克隆抗体为一抗对融合蛋白进行 Western blot分析，结果在38 kD都呈现特异性的条带(图5)。
Figure 5. Analysis of recombinant GSTVEGFD by Westen blot.Lane 1 and 3: GST control. Lane 2 and 4: GSTVEGFD fusion protein.
GSTVEGFD与VEGFR3/Fc的结合活性分析
将浓度为1、2 μg/ml的VEGFR3/Fc与20 μg/ml的GSTVEGFD混合，以VEGFR3/Fc纯品为对照，通过检测450 nm处的OD值分析GSTVEGFD与VEGFR3/Fc的结合活性，结果如图6所示，表明重组人GSTVEGFD可与VEGFR3/Fc相互作用。
Figure 6. In vitro characterization of GSTVEGFD and VEGFR3/Fc. GSTVEGFD fusion protein is able to interact with VEGFR3/Fc. Results are shown as the ±SD of three wells.
GSTVEGFD促进HEL细胞增殖
以GST为对照，检测GSTVEGFD对HEL细胞生长的影响，结果如图7所示。结果表明，与GST对照组相比，GSTVEGFD融合蛋白可显著刺激HEL细胞的增殖(F=17.01，P<0.0003),随着GSTVEGFD浓度的升高，HEL细胞量也随之增加(F=6.59,P<0.0002)，而随着GST浓度的升高，HEL细胞数量并没有明显变化(F=1.07,P>0.05)。这些结果说明GSTVEGFD融合蛋白在一定浓度范围内可以刺激HEL细胞的生长。
Figure 7. Stimulation of HEL cells proliferation with GSTVEGFD.Results are shown as the ±SD of three wells. *P<0.01, compared wtih GST.
GSTVEGFD对鸡胚尿囊膜血管的影响
鸡胚尿囊膜血管生成模型已经被广泛地应用在促进血管生成和抗血管生成分子的研究中。在我们的实验中，随着GSTVE
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