化后连入T载体。测序正确后，分别对载体pGEX5X1和连有目的片段的T载体进行NotⅠ和EcoR Ⅰ双酶切，构建重组表达质粒pGEX5X1/VEGFD，应用菌落PCR和酶切鉴定重组质粒。
GSTVEGFD融合蛋白在大肠杆菌中的表达
将pGEX5X1/VEGFD重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，挑取含pGEX5X1/VEGFD质粒的单菌落接种于含氨苄的LB培养基中，37℃培养过夜。按1%接种量转接到含氨苄的新鲜2YT培养基中，继续培养至OD600约为0.5-0.8,加入IPTG至终浓度0.2 mmol/L，30℃继续培养3小时后收集菌体。10% SDSPAGE分析融合蛋白表达情况。
收获的菌体重悬于pH 7.3的PBS中，于冰浴中超声破碎细胞，向超声破碎后的溶液中加入20% Triton X100至终浓度1%，冰浴30分钟，10 000×g离心收集上清和沉淀。10% SDS PAGE 进行检测。
重组GSTVEGFD融合蛋白的纯化
按GST预装柱参考说明书步骤进行。简述如下：用两倍柱体积的结合缓冲液平衡后，取5 ml过滤后的样品上样;流速约为0.2 ml/min，用5倍结合缓冲液洗涤;洗脱液洗脱，流速为1 ml/min。洗脱组分用SDSPAGE进行分析鉴定。合并目的蛋白组分，双蒸水透析，透析后的样品用冷冻干燥机干燥，-20℃保存。
Western blot鉴定
融合蛋白分别用抗GST抗体(1∶1 000)和抗VEGFD单然隆抗体(1∶1 000)进行检测，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1∶5 000)，用偶联辣根过氧化物酶的羊抗鼠抗血清(中杉金桥公司)和ECL试剂(Amersham)使结合的抗体显色。
VEGFR3/Fc 与GSTVEGFD的结合反应
分别以VEGFR3/Fc(0.5 μg/ml)和GSTVEGFD(4 μg/ml)包被ELISA板，4℃过夜,PBS洗后用含10 %小牛血清的PBS封闭。分别加入GSTVEGFD和VEGFR3/Fc孵育1小时, 用PBS+Tween 20洗3遍后加入抗VEGFD和VEGFR3/Fc的单克隆抗体, 孵育1小时, 用PBS+Tween 20洗涤, 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗, BCIP/NBT显色液显色,OD405nm检测。
MTT实验
HEL细胞按照1×105 /ml的浓度接种于96孔板,100 μl/well，分别加入不同浓度的GST、GSTVEGFD, 100 μl/well(每个浓度3个平行孔), 在37℃、5% CO2孵箱培养72小时后，每孔加MTT溶液20 μl，37℃孵育4小时后加入二甲基亚砜溶解沉淀，测OD492 nm值，用SAS 8.0作两因素的析因设计的方差分析。
鸡胚尿囊膜实验
将购自中国农业科学院畜牧研究所的受精卵鸡蛋于39℃孵育3天，无菌条件下加入不同剂量(5、10、20 μg/ml)的可溶性的GSTVEGFD蛋白，以GST为对照，用盖玻片盖住，石蜡封口，继续在38℃孵化3天后打开，拍照。用CMIASⅡ图像分析软件进行血管计数并计算血管面密度NA(V)。用SAS 8.0作单因素多水平方差分析。
统计学处理
采用SAS 8.0统计软件分析处理。
结 果
VEGFD片段的扩增
从人胎肺组织中提取总RNA，经RTPCR反转为cDNA。通过PCR法扩增目的片段后经1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，条带介于250和500之间，与理论推测值351 bp相符(见图1)。
Figure 1. Electrophoresis pattern of RTPCR of VEGFD mature fragment on agarose gel. Lane 1: DNA marker. Lane 2: VEGFD PCR product.重组质粒的构建与鉴定
PCR产物经纯化后直接连接到pGEMT载体上，构建pGEMT/VEGFD重组质粒，基因测序正确后用NotⅠ和EcoR Ⅰ双酶切连接到pGEX5X1上构建重组表达质粒pGEX5X1/VEGFD。 利用EcoR Ⅰ和NotⅠ进行重组质粒的双酶切鉴定(如图2)。重组质粒插入片段大小约为351 bp，证明pGEX5X1/VEGFD构建正确。
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