uld induce the CAM angiogenesis. It is concluded that the GSTVEGFD fusion protein with biological activity was successfully expressed, and which may provide an experimental model for the investigation of the VEGFDinduced angiogenesis and lymphangiogenesis.
Key words VEGFD;VEGFR3; angiogenesis; chick embnyo chorioallantoic menbreme
J Exp Hematol 2007; 15(2):364-368
肿瘤转移通常是人类癌症致死的主要原因之一。目前认为，肿瘤转移的通路主要有以下三种方式：第一，肿瘤细胞浸润血管，直接进入血道形成转移灶;第二，通过侵入已存在的淋巴管进入淋巴循环系统，进而通过淋巴血循环转移到新的组织中形成转移灶;第三，肿瘤细胞从实体瘤上脱落，直接种植到周边组织形成转移。在这些过程中，肿瘤细胞分泌各种生长因子，刺激肿瘤生成新生血管和淋巴管(lymphangiogenesis)，进而促进恶性肿瘤淋巴转移，其中血管内皮生长因子家族(vascular endothelial growth factor family， VEGF)及其受体血管内皮生长因子受体 (vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)信号系统在肿瘤血管发生和淋巴管发生过程中发挥了重要作用。 目前已经发现 5 种VEGF：VEGFA、B、C、D和胎盘生长因子(placenta growth factor，PIGF)。这些VEGF能选择性地与膜上的3种受体[VEGFR1(Flt1)、VEGFR2(KDR) 和 VEGFR3(Flt4)]中的1种或2种作用，促进血管增生和(或)介导淋巴管的增生[1]。 VEGFA和VEGFB能与VEGFR1、VEGFR2结合，刺激血管内皮增生并增加血管通透性，在血管新生(vasculogenesis)和血管增生(angiogenesis)过程中起重要作用[2]。VEGFC和VEGFD是近年发现的与淋巴增生相关的因子，VEGFC与VEGFR2和VEGFR3作用促进肿瘤淋巴管发生和转移[3,4]。VEGFD与VEGFR3和VEGFR2结合，不仅促进淋巴管的生成而且促进血管生成和发生[4,5]。
VEGFD以前体的形式合成，在结构上与VEGFC高度同源，经过翻译后加工去掉N端和C端多肽，成为含有VEGF同源区(VEGF homology domain, VHD)糖蛋白的成熟形式，提高了与VEGFR2，VEGFR3的结合能力[6]。本研究从人胎肺组织中克隆VEGFD基因的VHD片段，在大肠杆菌中进行表达，生物学活性检测结果表明重组GSTVEGFD不仅具有与VEGFR3/Fc结合的活性，还具有刺激红白血病细胞系HEL细胞生长和促进鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成的作用。
材料和方法
主要试剂
pGEX5x1表达载体和抗GST单克隆抗体均为Amersham公司产品;大肠杆菌BL21(DE3)菌株购自Novagen公司;GST预装柱及相关的纯化设备为Amersham公司产品;PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒和pGEMT连接试剂盒均购自Promega公司; 各种限制性内切酶购自Takara公司;抗VEGFD单克隆抗体购自R&D system公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为中杉金桥公司产品;HEL细胞购自中国医学科学院细胞库;MTT为Sigma公司产品;其余试剂均为国产分析纯。
VEGFD目的片段(VHD)的获得和重组表达质粒的构建
根据VEGFD的VHD片段的编码序列，设计合成PCR反应引物：正向：5′CCGGAATTCTTTGCGGCA ACTTTCTATGACATTG 3′;反向：5′ ATAAGAA TGCGGCCGCTCTTCTGATAATTGAGTATGGATGG 3′。从人胎肺组织中提取总RNA，用Invitrogen公司的Transcript反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，利用PCR反应从cDNA扩增目的片段。反应条件：94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分钟，进行30个循环。PCR产物纯
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