原代心肌细胞培养3 ｄ后进行实验分组，分为以下3组：①正常对照组（N组)：葡萄糖浓度为5.5 mmol／L;②高糖组（Ｈ组）：葡萄糖浓度为25.0 mmol/L；③高糖+Ghrelin组（G组）：酰基化Ghrelin终浓度为107 mol/L，葡萄糖浓度为25.0 mmol/L。
1.2.5 TUNEL法检测心肌细胞凋亡
将各组细胞爬片用PBS洗3次后，4％多聚甲醛固定30 min，采用TUNEL法检测细胞凋亡情况，同时设置阳性与阴性对照。检测结果判断：光镜下阳性细胞为细胞核中有深浅不一的棕黄色颗粒（DAB显色）。而正常非凋亡细胞及阴性对照胞核被苏木素复染呈蓝色。凋亡细胞分析：计数200倍视野下的凋亡细胞数及细胞总数，每组拍摄10个视野，计算凋亡细胞百分率(凋亡细胞/心肌细胞总数×100%)，重复5次。
1.2.6 caspase3活性测定
按照caspase3活性试剂盒说明书进行操作。收集各组实验细胞,PBS清洗2次，2 000 r/min离心5 min,去除PBS。沉淀细胞中加入50 μl预冷裂解液和0.5 μl DTT。 吹打，冰上裂解60 min，期间涡旋4次，每次10 s，4℃10 000 r ／min离心1 min，吸取上清至新管中置冰上，测蛋白浓度。各组应采用同样蛋白量进行实验，加入50 μl的2×Reaction Buffer和0.5 μl DTT，加入5 μl caspase3 substrate并于37℃ 避光孵育4 h ，分光光度计在400 nm波长测定其吸光值，计算OD诱导剂／OD阴性对照确定各组caspase3活性值。
1.3 统计学处理
数据以x±s表示，用SPSS11.0软件对数据进行各组间单因素方差分析。组间两两比较采用t检验。
2 结果
2.1 心肌细胞存活率测定
台盼蓝染色随即观察细胞存活率分别为95.4％，98％，96％。
2.2 心肌细胞形态学观察
刚接种的心肌细胞尚未贴壁，以圆形为主。8～12 h后，部分心肌细胞逐渐变形并贴壁生长，可出现单个细胞自发性搏动。24 h后观察细胞已大部分贴壁，单个搏动细胞数目增加，并逐渐在瓶底铺展，伸出伪足，相互接触交织成网，第48小时可形成呈同心圆放射状排列的细胞簇，搏动频率、节律、强度稳定，60～140次／min左右。
2.3 心肌细胞纯度鉴定
心肌特异性αactin单克隆抗体做免疫荧光染色鉴定，阳性率接近96％。见图1。
2.5 caspase3 活性测定 N组心肌细胞caspase3 活性较低；H组caspase3 活性较N组明显增加(P＜0.05)；G组caspase3活性较高糖组明显降低(P＜0.05)。见表1。表1 各组心肌细胞凋亡率及caspase3活性测定比较(略)
3 讨论
糖尿病心肌病是糖尿病主要的心血管并发症之一。越来越多的证据表明，心肌细胞凋亡与糖尿病心肌病密切相关，并在糖尿病心肌病的病程发展过程中起着重要作用。
Ghrelin是首先从大鼠胃黏膜中分离得到的一种含28个氨基酸的多肽，是生长激素促分泌素受体（GHSR）的内源性配体〔2〕。GHSR在全身多器官组织中广泛分布，心脏和血管均有表达〔3～5〕。Ghrelin与受体GHSR结合后，通过自分泌、旁分泌及内分泌形式发挥多种生物学效应。近期研究发现，除可刺激生长激素释放外，Ghrelin能够抑制多种细胞的凋亡〔6～12〕,如成骨细胞、脂肪细胞、胰岛β细胞、小肠上皮细胞、内皮细胞及大脑皮层神经元等。但目前尚未见Ghrelin对高糖环境下心肌细胞凋亡影响的相关文献报道。
本研究显示，H组心肌细胞凋亡率较N组明显增高，说明高糖环境可以增加心肌细胞凋亡。引起心肌细胞凋亡的机制尚不清楚，可能与高血糖状态下线粒体通路及死亡受体通路激活、PKC同工酶的凋节、P53基因的参与、活性氧物质的积累和氧化应激等有关〔13〕。与H组比较，G组心肌
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