【摘要】 目的 探讨Ghrelin对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响。方法 将原代培养的心肌细胞随机分为：①正常对照组（N组）；②高糖组（H组）；③高糖+Ghrelin组（G组）。应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测各组心肌细胞凋亡，分光光度法检测心肌细胞内caspase3活性的变化。结果 与N组比较，H组心肌细胞凋亡明显增加，caspase3活性显著升高；与H组比较，G组心肌细胞凋亡数量明显减少，caspase3活性明显降低（均P＜0.05）。结论 Ghrelin可能通过降低caspase3活性抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡。
【关键词】 Ghrelin；高血糖；心肌细胞；凋亡caspase3
心肌细胞凋亡是糖尿病心肌病主要病理改变之一，长期心肌细胞凋亡的发生，将会导致临床早期心肌舒张功能障碍、晚期合并心肌收缩功能障碍及心力衰竭的形成〔1〕。近期研究发现，Ghrelin可以抑制多种细胞的凋亡，如成骨细胞、胰岛β细胞、脂肪细胞、内皮细胞及神经元等，但Ghrelin对高糖环境下心肌细胞凋亡影响的相关文献报道较少。因此，本实验以高糖环境培养心肌细胞，Ghrelin作为干预因素，旨在探讨Ghrelin对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响，从而为糖尿病心肌病的防治提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞来源
新生1～3 d的SD大鼠的心肌细胞（重庆医科大学动物实验中心提供）。
1.1.2 主要试剂
Ghrelin(美国Phoenix Biotech公司)，DMEM培养基（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），Ⅱ型胶原酶及胰酶（均购于Sigma公司），PBS、αactin单克隆抗体、SABC试剂盒、TUNEL检测试剂盒及DAB显色试剂盒（均购于武汉博士德生物技术公司），caspase3 活性检测试剂盒（购于南京凯基生物公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 原代心肌细胞的分离与培养
取出生1～3 d龄SD大鼠10～15只，无菌条件下取心脏，仔细剥离心包膜去除心房及大血管，剩余组织于PBS液中漂洗多次，放于青霉素小瓶侧壁上，用眼科剪将心组织剪成约1 mm3碎块。加入5倍体积的0.08％胰蛋白酶，反复吹打后36℃水浴消化7 min，静置，待自然沉降后弃上清。剩余沉淀再加入约5倍体积0.08％胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶1∶1混合液，置36℃水浴消化5～8 min，静置后将上清液移入10 ml离心管中，反复吹打至无细胞团块后用等体积含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化。剩余沉淀用同样条件及方法继续消化，一般经8～10次消化即可将组织消化完毕。各次消化产物以1 000 r／min离心8 min，弃去上清液后将细胞重悬于含15％胎牛血清的DMEM培养液，然后接种于50 ml培养瓶，37℃，5％ CO2培养箱中孵育1.5 h去除贴壁的成纤维细胞。轻轻吸出上层细胞悬液，调整接种密度，将细胞接种于24孔板（板底铺盖玻片），置37℃，5％CO2培养箱中培养(培养液中加入5溴脱氧尿嘧啶0.1 mmol/L,以抑制成纤维细胞增殖)，培养48 h换液，以后每2 d换液1次。
1.2.2 台盼蓝拒染实验检测原代心肌细胞存活率
将0.4％台盼蓝溶液与细胞悬液等比例混匀，滴入细胞计数板，2 min后于倒置相差显微镜下计数，未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞，计算细胞存活率〔%，活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%〕，重复3次。
1.2.3 心肌细胞纯度鉴定
细胞培养第3天取出细胞爬片，4％多聚甲醛固定30 min后，用0.01 mol／L PBS漂洗3次。加入3％H2O2消除过氧化氢酶，封闭血清，室温封闭30 min后加入以１∶300稀释的兔抗大鼠特异性αactin抗体于4℃孵育过夜。然后分别用荧光标记的山羊抗兔ＩｇＧ抗体37℃避光孵育60 min。PBS清洗3次后立刻荧光显微镜下观察，绿色荧光染色的细胞即为阳性心肌细胞。阳性细胞百分率(%)＝阳性细胞数/细胞总数×100%，重复3次。
1.2.4 实验分组
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