72℃延伸10 min，置于4℃。(3)每个反应管中各取5 μl PCR反应物，加入适量TAE缓冲液及DNA凝胶电泳加样缓冲液，在0.8%～1%琼脂糖凝胶中电泳。
1.6 PCR产物的纯化（spinX纯化方法）。
1.7 Fd和轻链基因的克隆及噬菌体抗体库的建立
1.7.1 噬菌体载体pComb3 DNA的制备
将pComb3载体DNA转化XLIBlu感受态菌，挑取单个菌落接种入30～40 ml SBA+培养液，次日转种500 ml SBA+培养过夜DNA提取试剂盒1提取质粒DNA，最后制成5 μg/μl浓度左右的质粒DNA。
1.7.2 载体DNA和纯化PCR产物的酶切
首先将所有不同的重链PCR产物，κ链PCR产物，以及 PCR产物分别按各自组群混合。在pComb3系统中，用于重链插入的酶切位点为SpeⅠ和 XhoⅠ；而用于轻链插入的酶切位点为XbaⅠ和 SacⅠ。酶缓冲液的使用：酶切反应按常规进行，反应后进行电泳以纯化所需的片段。
1.7.3 Fd和轻链基因的克隆
（1）轻链抗体基因的克隆;取上述经XbaⅠ和 SacⅠ酶切消化，并经电泳纯化后的pComb3载体DNA 1.5～2 μg，轻链混合物500～700 ng，加2 μl高浓度连接酶进行连接。取事先制备好的电转感受态菌XLIBlue 400 μl加入上述连接产物，置冰浴中进行电转化。电转后立即转入细菌培养箱中。取30 μl培养液分别涂于含有氨苄青霉素的LB平皿，检测转化效率。用DNA纯化试剂盒制备上述含有轻链基因插入的pComb3质粒DNA，并测定DNA含量。鉴定插入效率，随即挑取20个克隆，提取质粒DNA后，用XbaⅠ和 XacⅠ酶切。（2）重链基因的克隆及噬菌体抗体库的建立:取上述的纯化pComb3LDNA质粒10 μg，混合的纯化重链PCR产物500 ng，用XhoⅠ和 SpeⅠ分别进行酶切反应。电泳回收相应的条带，纯化后测定DNA含量。取酶切消化后回收纯化的载体DNA及重链PCR产物进行连接。重复轻链克隆步骤。加入100 ml SBA+T+；37℃震荡培养1 h。加入1 012 pfu/ml的辅助噬菌体VSCM13，37℃震荡培养2 h。加入70 μg/ml卡那霉素，37℃震荡培养过夜。将上述细菌培养液于4℃以4 000 r/min离心15 min。取上清加入4%PEG8000和3%NaCl，待PEG和NaCl溶化后，置三角瓶于冰浴中沉淀30 min。于4℃以9 000 r/min离心20 min。用2 ml PBS（pH7.2）重悬噬菌体沉淀，瞬时离心，上清即为噬菌体抗体库，待用或存放于-20℃。
1.8 免疫印迹法鉴定初级抗体库中噬菌体上有Fab段的表达
将建成的噬菌体Fab初级抗体库悬液直接点于硝酸纤维膜（NC）片上，以pComb3噬菌体空载体悬液作阴性对照,进行免疫印迹分析，显色后对两组NC膜进行比较，鉴定初级抗体库中噬菌体上有Fab段的表达。
2 结果
2.1 大肠癌淋巴结抗体重链Fd基因和轻链基因的扩增及鉴定
采用Trizol一步法自大肠癌患者转移淋巴结中提取总RNA后，以其为模板RTPCR合成抗体重链Fd和轻链基因cDNA，再以该cDNA为模板，PCR扩增抗体重链Fd和轻链基因，在1%琼脂糖凝胶DNA电泳中，可获得650 bp产物条带，即为重链Fd和轻链基因产物，见图1。
2.2 轻链和重链Fd基因的克隆及噬菌体Fab抗体库的建立
将PCR扩增的轻链基因产物插入载体pComb3后，电转感受态XLIBlu菌，扩增培养后，测得转化菌数为4.7×106，随机挑取20个单菌落，提取质粒DNA，鉴定插入率为70%，见图2。将PCR扩增的重链Fd基因产物插入有轻链基因插入的pComb3载体DNA pComb3L，电转感受态XLIBlu菌，扩增培养后，测得转化菌数为3.5×106，随机挑取20个单菌落，提取质粒DNA，鉴定轻链基因的插入率为60%，见图3。
2.3 鉴定初级抗体库中噬菌体上有Fab段的表达
以辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗人IgG行免疫印迹检测醋酸纤维膜上Fab初级抗体库，结果均显色
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