LLCPK1(猪近端肾小管上皮细胞)转染空的载体和人的MRP2cDNA得到的二株稳定细胞株。用含10%胎牛血清(100u/ml青霉素、100u/ml链霉素)的RPMI1640培养液在37℃、5%CO2条件下培养。细胞传代用含0.25%胰蛋白酶液消化。选取对数生长期细胞进行实验。
1.3.2 MTT快速比色法试验 将处于对数生长期的LLC/cMOAT，LLC/CMV细胞的细胞数调整至3×104/ml，取96孔板每孔加入200μl细胞悬液，置37℃、5%CO2培养箱过夜。去掉培养基，分别加入上述六种化疗药物200μl。化疗药物作用浓度 (μmol/L)按照实验要求设置倍增浓度的各抗肿瘤药物(根据各药物临床血药浓度确定，本实验在血药峰浓度的0.01～100倍之间设立7个浓度级)及逆转剂TA(根据TA的细胞毒性确定各自的浓度)，每种浓度设6个复孔，同时设不加细胞、只加各药的空白对照，以及只加细胞不加任何药物的阴性对照。继续在96孔板中培养72h。每孔板加入20μlMTT(5mg/ml), 4h后终止培养，离心吸弃上清液，每孔加150μlDMSO，振荡10min使结晶物充分溶解。由空白孔调零后，以酶标仪检测570nm处光吸收值(OD)。
(1)检测LLC/cMOAT细胞对抗肿瘤药物的耐药性 根据临床用药的血药浓度设计一定的抗肿瘤药物的浓度范围，测定VP16、TAX、VCR、ADM、DDP、CPT11对LLC/CMV、LLC/cMOAT细胞的半数抑制浓度(IC50)，求出LLC/cMOAT细胞对VCR等抗肿瘤药物的耐药倍数。
按下列公式计算抑制率：
抑制率(IR，%)=对照组OD值-实验组OD值/对照组OD值 × 100%
以药物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘制浓度效应曲线，确定IC50。
耐药倍数(RF)=耐药细胞 IC50/ 亲本细胞IC50
(2)确定TA对LLC/CMV和LLC/cMOAT的非细胞毒性浓度 设置不同浓度的TA，观察细胞的存活状态，求出它们的抑制率,从而确定10% IR的TA浓度，选择在此非毒性浓度以下进行药物增敏试验。
(3)TA对LLC/cMOAT多药耐药的逆转 将不同浓度的TA与VCR联合应用，测定细胞对VCR药敏性的改变情况
逆转倍数(RI)= IC50(LLC/cMOAT单用VCR)/IC50(LLC/cMOAT联用TA+VCR)
1.3.3 流式细胞仪(FCM)测定LLC/cMOAT细胞内DNR荧光强度 取对数生长期的细胞，以2×107/L接种到25ml培养瓶中，每瓶5ml;细胞贴壁24h，每一浓度各3瓶，每瓶加入不同浓度的TA 1ml，TA作用24h后每瓶加入DNR(终浓度为2μmol/L) 1ml;DNR作用3h后，收集细胞，冷PBS吹洗3次;1ml冷PBS吹散细胞;按DNR本身发红色荧光的特点，参考Kato等[4]的方法，FCM检测细胞内DNR荧光强度,以DNR荧光强度代表DNR浓度。
1.3.4 PI染色检测细胞周期及凋亡 将不同浓度的TA、VCR、TA与VCR(终浓度为0.4μmol/L)分别加入培养的LLC/cMOAT细胞中，孵育一定时间后取出收集细胞，细胞数约1×106/ml,PBS洗3次，1000r/min离心5min去上清。加入75%的乙醇固定，放入冰盒中送检。上机前准备：PBS洗1次5min;加PI荧光染色液(5mg/L PI,20mg/L RNA酶)于4℃冰箱中放置45min;过夜。300目的筛网过滤1次,记数10000个细胞检测细胞周期及凋亡。
1.4 统计学方法 计量资料用±s表示，两组间均数的比较采用t检验，不同处理组率的比较采用χ2检验，采用SPSS11.0统计分析软件进行统计学处理。
2 结果
2.1 LLC/cMOAT细胞的多药耐药性
CPT11、ADM、DDP和VCR对LLC/cMOAT的IC50明显较对LLC/CMV细胞的IC50高，差异有统计学意义(P<0.05)。LLC/cMOAT对VP16和TAX均未产生耐药性，见表1。表1 LLC/CMV和LLC/cMOAT对常用化疗药物的
敏感性及耐药程度(n=6)IC50(μmol/L)LLC/CMVLLC/cMOAT耐药倍数VP16 6.364±0.759 7.243±0.7581.14 TAX 4.025±0.372 4.473±0.3851.11 CPT1123.026±4.51247.968±5.3262.08*
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