不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃ 60 min；0.5 mol/L PBS洗5 min×4次。滴加生物素化过氧化物酶，37℃ 20 min；0.5 mol/L PBS洗5 min×4次。AEC显色，水溶性封片剂封片。评分方法同前。
1.5 MMP1、TIMP1 mRNA检测
采用RTPCR检测。应用Trizol试剂提取肾组织总RNA，并按照逆转录试剂盒要求制备cDNA，随后进行PCR以扩增目的片段，βactin作为内参照，扩增引物序列如下：MMP1正义链：5′TGG ACC TGG AGG AAA TCT TGC3′，反义链：5′AGA GTC CAA GAG AAT GGC CGA3′；TIMP1正义链：5′ACT GCA GGA TGG ACT CTT GCA3′，反义链：5′TTT CAG AGC CTT GGA GGA GCT3′；βactin正义链：5′ TAC CGC TTC ACC ACC ACA GC3′，反义链：5′ AGG GAA GGC TGG AAA AGA GC3′。取cDNA 2 μl，加入引物2 μl、缓冲液5 μl、dNTP 5 μl、Taq酶1/8 μl，加双蒸水至50 μl。扩增条件为：变性：94℃，30秒；退火：55℃～59℃ 30 s；延伸：72℃ 30 s；30个循环。使用Gene Amp PCR系统9700(USA)。最后取20 μl扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，于紫外灯下拍照，将胶片上的反应条带在IBAS2000图像分析仪中扫描。MMP1、TIMP1、βactin相对含量用相同PCR反应中光带的强度表示。
1.6 统计学处理
数据以x±s表示，使用SPSS10.0统计软件，计数资料比较用秩和检验，两组均数比较用t检验。
2 结果
2.1 肾脏组织学改变
肾组织HE染色肾上腺髓质素基因敲除及野生小鼠假手术组均未见异常，模型组表现为近曲小管上皮细胞水肿、远曲小管扩张，上皮细胞坏死、脱落及细胞管型形成，大量炎性细胞浸润。缬沙坦治疗组略轻于模型组，但无明显差别。Masson染色显示：假手术组小鼠肾脏无异常；模型组肾组织切片表现为小管扩张，小管基底膜变薄，并出现了小管萎缩，间质胶原成分明显增多；缬沙坦治疗组胶原成分增多但较模型组为轻。与野生小鼠相比，基因敲除小鼠模型组胶原成分明显增多，经缬沙坦治疗有所改善。
2.2 MMP1、TIMP1免疫组化表达、分布及半定量分析
2.2.1 MMP1蛋白表达、分布及半定量分析
免疫组化结果显示野生小鼠及肾上腺髓质素基因敲除小鼠假手术组肾脏MMP1中度表达，主要位于肾小管上皮细胞；UUO后表达减弱，与假手术组相比有显著差异(P＜0.01)；给予缬沙坦治疗后，表达稍增强。两组小鼠相比，模型组和缬沙坦组基因敲除小鼠表达减弱但无显著性差别，见表1。表1 各组小鼠肾脏MMP1/TIMP1免疫组化、原位杂交结果及MMP1/TIMP1 mRNA表达比较(略)
2.2.2 TIMP1蛋白表达、分布及半定量分析
结果显示野生小鼠及基因敲除小鼠假手术组肾脏TIMP1呈中度表达；模型组表达明显增强，与假手术组相比有显著性差异(P＜0.01)；缬沙坦治疗组表达亦增强。两组小鼠相比，模型组与缬沙坦组基因敲除小鼠TIMP1表达均增强(P＜0.05)，见表1。表1 各组小鼠肾脏MMP1/TIMP1免疫组化、原位杂交结果及MMP1/TIMP1 mRNA表达比较(略)
2.2.3 MMP1/TIMP1比较
结果显示野生及基因敲除小鼠假手术组相比为1；野生小鼠模型组相比为0.56，基因敲除小鼠为0.42；野生小鼠缬沙坦组相比为0.72，基因敲除小鼠为0.76，说明在UUO诱导的肾间质纤维化实验中，存在MMP1/TIMP1的失衡，而这一失衡与肾上腺髓质素相关。
2.3 MMP1、TIMP1原位杂交表达、分布及半定量分析
2.3.1 MMP1原位杂交表达、分布及半定量分析
原位杂交测定MMP1基因表达，结果证实野生小鼠假手术组为中等强度表达，
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