rcinoma, non-small cell lung; Cytokines; In situ hybridization
非小细胞性肺癌(NSCLC)是常见的恶性肿瘤,发病率逐年上升。其治疗手段有限、预后差,尤其是免疫治疗的疗效甚微,其疗效的提高有赖于对肿瘤局部免疫微环境的深入了解。本研究采用原位杂交技术检测了NSCLC肿瘤局部较为重要的13种细胞因子的表达,并探讨了各种细胞因子的表达与肿瘤病理分期的关系。另外,在单细胞水平上,检测了癌性胸腔积液的淋巴细胞中上述13种细胞因子的表达,并以结核性胸膜炎病人胸腔积液中的淋巴细胞作为对照,探讨了肿瘤局部的免疫微环境对抗肿瘤免疫应答的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
5例结核性胸膜炎病人的胸腔积液标本及23例NSCLC病人(腺癌15例,鳞癌8例)的肿瘤组织标本,均来自青岛大学医学院附属医院。寡核苷酸地高辛标记试剂盒购自德国宝灵曼公司。细胞因子的寡核苷酸探针由上海博亚生物技术公司合成。
1.2 方法
1.2.1 寡核苷酸探针的制备 应用Primer 3软件设计针对细胞因子的寡核苷酸探针。探针的特异性均经BLAST软件测试,显示具有良好的特性。检测各种细胞因子mRNA的探针序列如下。IL-1：5′-ATGATAGAAGGATTTCTGATTCAGAGA-3′;IL-2:5′-GTTCTTCTTCTAGACACTGAAGCTGT-T-3′;IL-3：5′-TGCTTTAAGTGTGTTATAATTT-CATCG-3′;IL-4：5′-ATATTCAAAGTGTTCGAG-CTGAATATT-3′;IL-8：5′-TTGTTTGTTTGTT-TAATCTAAAAACCC-3′;IL-10：5′-AGGCTTCT-ATGTAGTTGATGAAGATGT-3′;IL-12:5′-ATGGATCAGGTCATAAGAGTATGAAAC-3′;IL-18：5′-AGAGAACTTGGTCATTCAAATTTCTT-A-3′;IFN-γ：5′-TCAGTTACCGAATAATTAGT-CAGCTTT-3′;TGF-α：5′-TTCTTCTCTAGGTCA-CACTGAATAACC-3′;TGF-β1：5′-CCAAGGTGCTCAATAAATAGATCTAAC-3′;GM-CSF：5′-CAAACATTTCTGAGATGACTTCTACTG-3′;TNF-α：5′-AACTTTATTTCTCGCCACTGAATAGTA-3′。将13种细胞因子分为5组:IL-2、IFN-γ、IL-12和IL-18为Th1型细胞因子;IL-4和IL-10为Th2型细胞因子;TGF-β1为免疫抑制细胞因子;IL-1、IL-3、IL-8为致炎细胞因子的代表;TGF-α、TNF-α和GM-CSF。采用地高辛(DIG)寡核苷酸末端标记试剂盒标记探针,标记过程严格按照产品说明书进行，标记的探针活性为1.56 nmol/L。
1.2.2 细胞因子的原位杂交 细胞涂片和组织石蜡切片的制备：整个操作过程均在无酶的环境中按常规操作进行。组织切片经脱蜡、消化和固定,并经梯度乙醇脱水后，室温干燥，于42 ℃先加预杂交液10~30 mL在盒内预杂交2 h，然后加杂交液10~30 μL，在42 ℃杂交22 h。以梯度标准枸橼酸盐水(SSC)充分洗涤后，加抗体于37 ℃作用2 h，再以NBT-BCIP显色18 h。用Buffer Ⅲ作用5 min终止显色反应，加10 g/L甲基绿复染1~2 min，依次进行流水冲洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明及封片后镜检。对照设置：将探针和抗体用PBS取代或将切片在37 ℃ RNase A (20 mg/L) 处理3 min, 分别作为细胞涂片和石蜡切片的阴性对照;以正常人活化的外周血淋巴细胞中的IL-2和INF-γ mRNA作为细胞涂片的阳性对照;以慢性扁桃体炎组织中IL-2和INF-γ mRNA的表达作为石蜡切片的阳性对照。结果判定：光镜下细胞质中出现紫蓝色沉淀者为阳性杂交信号;阴性对照无杂交信号，甲基绿复染的细胞质不着色，胞核呈绿色。在装有网格目镜的高倍镜下,每张切片随机取5个视野,计数200个细胞,计算阳性细胞的百分数,并根据细胞中阳性颗粒数的多少及颜色的深浅分为：阴性(-)、弱阳性(+)、阳性()、强阳性()，并分别记为0、1、2、3分。将阳性细胞的百分率与染色强度积分的乘积作为积分指数(IE)。
1.2.3 统计学处理 数据以x±s表示，用ANOVA和Student t检验进行显著性分析。
2 结 果
2.1 胸腔积液
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