单层Hela细胞，移去培养基,用DMEM洗一次，加入0.5mL 30μg/mL的DEAE葡聚糖,37℃10min。弃掉DEAE,加入适当稀释的肺组织匀浆上清液,每孔200μL,室温下1000rpm/min离心1h,吸去上清液，加入含有2μg/mL放线菌酮(cycloheximide)、10μg/mL庆大霉素及100mL/L FBS的DMEM,每孔1mL,37℃5% CO2条件下培养22h。吸掉培养基,用1×PBS洗一次,加入含有2%PF的1×PBS0.5mL,室温固定30min,然后加入含有2%Sapornin的0.05%PBST室温1h。吸掉孔内液体,加入含10%FBS的DMEM0.5mL，37℃封闭1h。吸掉孔内液体加入一抗(含10%FBS的DMEM10mL,R@CT395 5μL,MB5H9 100μL,由Dr.ZHONG实验室提供)，37℃作用1h。用1×PBS洗3次,每次放置5min，最后风干。加入20μL二抗(1mL 10%FBS DMEM,5μL G@RIgGCy2,5μL G@M IgGCy3,2μL hoechst),37℃作用1h。用1×PBS洗3次每次放置5min，然后封片,在荧光显微镜下计数包涵体个数以IFU表示。每个盖玻片随机计数5个视野，若视野不足1个IFU的，计数整个盖玻片,呈明显细胞毒性的细胞不在计数之内。每个器官的总IFUs计数为每个视野的IFUs,每个盖玻片的计数视野，肺组织上清液的稀释倍数和总体积的综合计数。
1.6 统计分析
结果用均数±标准差(x±s)表示，组间差异用t检验。
2 结果
2.1 衣原体在小鼠肺组织的生长 用小鼠肺组织匀浆做衣原体活性测定,于感染后第1天，Hela细胞内可见有衣原体包涵体生长，IFU数值随着感染进程持续增高，于感染后第8天IFU达峰值,以后逐渐下降(图1)。
图1 MoPn呼吸道感染小鼠肺组织IFU生长计数2.2 衣原体MoPn肺感染早期诱导IL17的表达 用小鼠肺组织匀浆进行IL17 ELISA测定，发现IL17表达在感染48h后达到峰值(图2)，但IL17的产生是暂时的，到第4天，几乎检测不到明显的IL17表达(IL17ELISA试剂盒的工作范围是15.6～1 000pg/mL)。
图2 MoPn呼吸道感染小鼠肺组织IL17的表达2.3 衣原体MoPn肺感染诱导前炎症细胞因子和趋化因子的表达 本实验同时测定了小鼠肺组织匀浆TNFα(图31)、IL1α(图32)、IL1β(图33)、IL6(图34)和IL8(图35)的表达情况，这些细胞因子在整个感染过程中均可检测到，TNFα、IL1α、IL1β和IL6在感染后第3天达到峰值，而IL8则在第4天出现高峰。
3 讨论
IL17在炎症病理和宿主防御多种微生物感染中具有重要的作用。然而，IL17在由严格的细胞内寄生病原体如沙眼衣原体引起的感染中的作用尚不清楚。
本研究用沙眼衣原体体内感染模型证实IL17在感染衣原体后在固有性免疫应答早期阶段短暂表达，从而有利于小鼠肺组织逐渐清除感染的衣原体。
本研究发现，鼠衣原体MoPn经呼吸道感染小鼠，IL17作为Th17细胞分泌的标志性细胞因子，在感染的早期阶段即48h就达到高峰，随后很快下降。尽管IL17并不直接影响衣原体在细胞内的生长，但其可以提高其他前炎症细胞因子和趋化因子在衣原体感染的细胞中表达，参与衣原体感染免疫防御作用。这些结果显示IL17早期表达可能作为固有免疫应答因子在起动宿主抵御细胞内病原体在早期呼吸道衣原体感染炎症应答中发挥重要的作用。
IL17在感染的肺组织早期出现，意味着小鼠早期固有免疫应答机制在应对急性感染中的作用。这个结论与获得性免疫反应发生在抗原暴露4d后概念相一致。事实上，早期IL17在呼吸道的产生也被诱导和作用于防御其他呼吸道病原体，包括肺炎支原体[12],肺炎克雷伯氏杆菌[13]和牛分枝杆菌[14]。这些病原体都触发了IL17的短暂产生，峰值出现与病原体复制速度呈一定的相关性。肺炎支原体感染，IL17峰值出现在第1天，肺炎克雷伯氏杆菌和牛分枝杆菌感染，峰值则分别出现在第2天和第3天，这些结果均支持本研究IL17的产生依赖于衣原体的复制和合成。事实上，除了CD4+T细胞参与获得性免疫反应，TCRγ/δT细胞、类NKT细胞、NK1.1negiNKT细胞和中性粒细胞[1518],都能参与固有性免疫反应，也能产生IL17。这些细胞可能是宿主在感染衣原体后IL17早期产生的细胞基础。
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