R MasterMix 12.5 μL(包括0.1 u Taq DNA聚合酶、每个500 μmol/L dNTP、20 mmol/L Tris-HCl、pH8.3、20 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2、其他稳定剂和增强剂)，加双蒸水补充至25 μL。扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸7 min。PCR扩增完成后，取8 μL PCR扩增产物，20 g/L琼脂糖凝胶电泳(溴化乙锭染色)观察扩增情况，若出现312 bp清晰条带，则进行Mbo Ⅰ内切酶酶切分析。酶切反应体系10 μL，取8 μL PCR扩增产物、10×Buffer 1.0 μL、BSA 0.1 μL、限制性内切酶Mbo Ⅰ 1.0 μL(10单位)，于37 ℃温浴3 h，30 g/L琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。hPOT1 IVS13-98G/T分为3种基因型，GG、G和TT型(图1)。选择凝胶电泳证实为GG型、GT型、TT型各1例，由大连宝生物公司经双脱氧链终止法测序。
1.3 H.pylori的检测
1.3.1 PCR检测UreA基因
引物参照文献由上海生工合成[4]。上游引物：5′GCCAATGGTAAATTAGTT3′;下游引物：5′CTCCTTAATTGTTTTTAC3′，扩增片段长度为411 bp。反应体系为25 μL，包括2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，去离子水9.5 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min 1个循环;94 ℃ 1 min，47 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min。产物于20 g/L的琼脂糖凝胶(溴化乙锭染色)电泳，紫外灯下观察结果。出现411 bp橙色条带的为H.pylori阳性，无条带则为阴性。
1.3.2 Warthin-Starry 银染色
阳性结果为细胞核和H.pylori均着棕黑色,细胞浆和黏液着浅黄色。PCR扩增和Warthin-Starry银染色均阳性者判断为H.pylori感染。
1.4 统计学分析
应用SPSS13.0统计软件处理。采用χ2检验比较hPOT1 IVS13-98G/T胃癌组和对照组的基因型分布和等位基因频率;用Hardy-weinberg平衡检验两位点基因型和等位基因频率分布是否具有群体代表性。OR和95%CI以非条件logistic回归模型计算。所有检验均为双侧概率检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 两组hPOT1 IVS13-98G/T各基因型及等位基因分布
胃癌组hPOT1 IVS13-98 GG、GT和TT基因型的频率分别为22.00%、41.67%和36.67%，G、T等位基因频率分别42.67%和57.33%;对照组GG、GT、TT基因型的频率分别为24.36%、51.92%、23.72%，G、T等位基因频率分别为49.68%和50.32%。两组G、T等位基因型频率比较无显著性差异(χ2=3.0257, P=0.0820)。以T/T基因型作为参照基因型，G/T和G/G两种基因型OR值分别为0.432(95% CI: 0.242-0.772, P=0.005)、0.540(95% CI: 0.274-1.064，P=0.075)。胃癌中3种基因型H.pylori的检出率无统计学意义(P>0.05)。
2.2 H.pylori感染与hPOT1基因单核苷酸多态性的关系
H.pylori(+)者81例，占54.00%，H.pylori(-)者69例，占46.00%;在hPOT1 IVS-98 G/T三种基因型中，GG基因型H.pylori检出率为51.52%，GT基因型为45.16%，TT基因型为65.45%，三型之间比较差异无统计学意义(χ2=4.937, P=0.085)。提示胃癌患者hPOT1 IVS-98 G/T多态性与H.pylori感染无关(表1)。表1 胃癌组H.pylori感染与hPOT1IVS-98 G/T多态性的关系(略)
3 讨 论
hPOT1基因位于7q31.33，编码蛋白质是单链端粒DNA结合蛋白。作为多蛋白复合体(TERT、POT1、TNKS、TERF1、TINF2和TERF2)成员之一，有其特有的分子结构，与端粒TTAGGG重复单链序列结合，有5种剪接变体，产生5种变
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