mol/L的脲素中浸泡30 min;移入3%(体积分数)双氧水中孵育10 min;用微波炉热修复抗原; 加入5%(体积分数)马血清室温30 min;加入1∶100稀释的兔抗大鼠5-HT多克隆抗体4 ℃冰箱内孵育过夜，次日在37 ℃复温90 min;0.01 mol/L PBS冲洗3次;加入DAKO Evision系统37 ℃ 40 min;0.01 mol/L PBS冲洗3次;DAB显色5 min，终止反应，苏木素轻度复染，脱水透明，显微镜下观察结果。其中一抗和二抗用含10 mL/L马血清和3 g/L Triton-X100的0.01 mol/L的PBS稀释，阴性对照实验用PBS替代5-HT抗体作为一抗进行孵育，采用人脑组织的病理切片作为阳性对照。病理切片在Olympus CHB显微镜下连续观察10个高倍视野(10×40，约5 mm的标本长度)，计数肠肌间神经丛内5-HT阳性的肠神经元的数量，计算出平均每mm的阳性神经元数量。
1.2.3 肠肌间神经丛5-HT3受体含量的检测
①肠肌间神经丛铺片的制备：处死大鼠后，取新鲜远端结肠肠管3 cm，用0.01 mol/L PBS冲洗后用40 g/L多聚甲醛液充盈，将肠管两端结扎紧，立即用40 g/L多聚甲醛液固定3 h，再移至250 g/L蔗糖4 ℃过夜。次日沿肠系膜处剪开肠管，再将组织剪成0.5 cm×0.5 cm的组织块，在解剖显微镜下用钟表镊剥除黏膜层和黏膜下层，再用镊尖轻轻挑去附于肌间神经丛的环行肌，即得位于环行肌和纵行肌之间的肌间神经丛。②免疫组化染色：肠肌间神经丛铺片用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)冲洗3次;移入80%(体积分数)甲醇双氧水中孵育10 min;加入5%(体积分数)马血清室温30 min;加入1∶50稀释的兔抗大鼠5-HT3多克隆抗体室温下轻摇3 h，再转入4 ℃冰箱内孵育48 h，37 ℃孵育箱中复温90 min;0.01 mol/L PBS冲洗3次;加入DAKO Evision系统室温下轻摇3 h;0.01 mol/L PBS冲洗3次;DAB显色15-20 min，终止反应，脱水透明，封片后显微镜下观察结果。其中一抗用含10 mL/L马血清和3 mL/L Triton-X100的0.01 mol/L的PBS(pH 7.4)稀释，阴性对照实验用PBS替代5-HT3抗体作为一抗进行孵育。采用Aristoplan Q570C图像分析仪，每个标本随机选取5个高倍视野测定免疫组化染色阳性部位的灰度值，计算平均值。
1.2.4 肠肌间神经丛5-HT4受体含量的检测
方法同肠肌间神经丛5-HT3受体含量的检测。5-HT4受体的稀释比例为1∶80。图像分析同5-HT3。
1.3 统计学分析
使用SPSS11.0软件进行统计分析，多组间比较采用方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，以P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 大鼠肌间神经丛5-HT含量的检测结果
各组大鼠肌间神经丛5-HT阳性肠神经元数目差异有统计学意义(F=17.984，P<0.01)。IBS-D组大鼠肌间神经丛5-HT阳性肠神经元数目[(4.37±0.88)个/mm]显著高于对照组[(2.99±0.41)个/mm](P<0.01);IBS-C组[(3.04±0.35)个/mm]和对照组无差异(P>0.05，图1)。
2.2 大鼠肌间神经丛5-HT3、5-HT4受体含量的检测结果
各组大鼠肌间神经丛5-HT3受体免疫组化染色的灰度值无显著性差异(F=0.082，P=0.922，表2)。而5-HT4受体免疫组化染色的灰度值差异有统计学意义(F=40.108，P<0.01)。IBS-D组大鼠肌间神经丛内5-HT4受体免疫组化染色的灰度值显著低于对照组和IBS-C组(P<0.01)，而IBS-C组与对照组差异无统计学意义(P>0.05，表1、图2)。 表1 各组大鼠肌间神经丛5-HT3、5-HT4受体阳性的免疫组化染色的灰度值(略)
3 讨 论
IBS是一种常见的功能性胃肠道疾病。目前认为它是最能体现生物学和社会心理因素相互作用的一种疾病，其发病与胃肠道动力的改变、内脏痛觉过敏、脑肠相互作用的紊乱、感染等因素有关[2]。模拟人IBS的动物模型报道较多，但多为用大鼠模拟IBS-D，而IBS-C的动物模型报道较少，并且对IBS两型发病机制差异的研究未涉及肠肌间神经丛和黏膜下神经丛的改变。在以往的研究中，我们验证了
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