奥曲肽对人胃癌细胞增殖的抑制作用研究

　　Key words: gastric cancer; somatostatin; cell cycle; epidermal growth factor; transforming growth factor-alpha

　　奥曲肽(octreotide， OCT)是人工合成的生长抑素八肽类似物，近年来在肿瘤治疗方面的应用日益受到关注,尤其对胃肠肿瘤显示了独特的优势[1]。本研究通过探讨OCT对胃癌细胞系MKN45细胞多种生物学行为的调控作用，为其治疗胃实体瘤提供实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞、动物及试剂 人胃癌细胞株MKN45购自中国科学院上海细胞库，4～6周龄BALB/c 裸鼠购自上海肿瘤研究所。OCT(0.1 mg/支，瑞士诺华制药)， RPMI 1640培养基(Gibco)，胎牛血清( 杭州四季青公司)，胰蛋白酶、Propidium iodide(PI)、3-(4，5-dimethylthiazol-2-YL)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) (Sigma)，生长抑素(EGF) RIA试剂盒(北京华英放射免疫技术研究所)、转化生长因子-α(TGF-α) RIA试剂盒(中国人民解放军总医院放免研究所)。

　　1.2 细胞培养 人胃癌细胞株MKN45生长于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，内加青霉素100×103 U/L，链霉素100 mg/L，37℃、5%CO2浓度及饱和湿度条件下常规培养。细胞呈单层贴壁生长，每3～4天以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA(1∶1)消化液消化传代。

　　1.3 MTT比色分析法 对数生长期的MKN45细胞消化后调整细胞密度为1×105/ml，接种于96孔板，每孔100 μl，另加培养基100 μl。37℃、5% CO2条件下培养24 h后，更换无血清培养基继续培养24 h分组：设空白组(不加细胞)、对照组(不加药)、OCT组(分为10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L 4个浓度)，每组6个复孔。继续培养72 h，每24 h更换新鲜培养基和奥曲肽。终止培养前4 h加入 MTT 40 μl/孔，避光孵育。结束培养时，吸去全部上清液，加入DMSO 200 μl/孔，微孔板震荡器震荡10 min，酶联检测仪上测定光密度(D)值(λ=550 nm)。按下列公式计算细胞抑制率：

　　抑制率=[(对照组D值-空白组D值)-(实验组D值-空白组D值)]/(对照组D值-空白组D值)×100%

　　1.4 平板集落形成实验 对数生长期的MKN45细胞消化后吹打成单细胞悬液。将1000个细胞接种于含液体培养基的普通平皿中(平皿直径为9 cm)，分设对照组(不加药)和OCT组(培养基中加新鲜OCT，浓度为10-6 mol/L)，37℃、5%CO2孵箱中培养至细胞形成典型集落;以包含50个以上细胞为一个集落进行计数，普通平皿中的细胞经固定、苏木精-伊红染色、倒置显微镜下计数细胞集落。

　　1.5 流式细胞技术检测细胞周期 对数生长期的MKN45细胞消化后调整细胞密度为1×105/ml，接种于50 ml培养瓶，每瓶2 ml。无血清培养基同步化24 h后分组，设0、6、12、24、36、48 h共计6个时间点，各组分别设对照组(不加药)、OCT组(OCT浓度为10-6 mol/L)。每天更换含新鲜OCT的培养基。培养结束，吸去上清，常规消化后1000 r/min离心10 min收集细胞，70%冷乙醇1 ml固定过夜。PBS洗涤后1500 r/min离心5 min去除乙醇，PI染液避光孵育30 min，上机检测。

　　1.6 裸鼠成瘤实验 对数生长期的细胞消化后PBS清洗细胞3次，无血清培养液重悬，调整细胞密度为1×107/ml，裸鼠皮下注射0.1 ml 的细胞悬液。成瘤后分设对照组和OCT组(尾静脉每日注射OCT 100 mg/d)，每组4只裸鼠。密切观察裸鼠的体重和全身健康状态，成瘤4周后处死裸鼠;剥离肿瘤组织并称重。

　　1.7 上清液TGF-α、EGF含量测定 对数生长期的MKN45细胞消化后调整细胞悬液细胞密度为1.2×105/ml，接种于96孔板，每孔接种250 μl，37℃、5% CO2条件下培养。分组：对照组和OCT组(OCT浓度为10-6 mol/L)。分别于24、48、72

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