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应用激光捕获显微切割技术制备肺癌蛋白质组学研究样品 |
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不同类型肺癌组织，获得250个帽子收集装置和8.7×106个细胞数。从捕获操作过程中我们发现，捕获细胞的同质性、细胞收集率以及操作过程所耗费时间是影响激光捕获及后续蛋白质组学实验结果的关键因素。由于LCM是在直视下操作，细胞纯度可以保证。经随机抽取3组、45个帽子收集装置，使用Pixcell II显微激光切割系统内标记尺划分观察视野，抽样估算收集装置内细胞同质性可达到95%以上，该结果与文献报道一致[7]。当然，文献报道最多的是关于基因和分子水平的研究，但其中的切片制作和LCM切割部分是相同的。Pixcell II显微激光切割系统是新一代系统，该系统的优点是使用的是乙烯乙酸乙烯酯膜的塑料帽(ethylene vinyl acetate caps, EVA caps)细胞收集装置，可避免操作者手接触所收集到的细胞，减少污染机会。EVA膜需要和细胞紧密接触才能够被激光束融化而将目标细胞收集，因而LCM过程受很多因素影响而不能保证将每个捕获细胞均能收集。激光捕获仪主要参数有：Power、Duration、Spot size、Repeat及Current等。一般在打开系统进行切割之前，应先在帽子空白区空打5-6次，观察激光能量，光点大小是否合适，以光点能够完全覆盖目标细胞为宜。本实验中所选择条件是：Power 100mW、Duration 15.5ms、Spot size 7.5-15μm、Repeat 0.2s、Current 8.0mA。Zhukov等[8]应用LCM切割肺癌组织时认为，鳞癌可选择7.5μm激光束，腺癌中用15μm，可获得较好效果。在本实验中，我们发现激光束的大小与鳞癌和腺癌组织类型关系不明显，但与切片的制作和捕获操作过程关系较大，切片的厚度、脱水时间和EVA膜是否和细胞紧密接触是重要影响因素。制作切片时应将切片厚度控制于8-9μm，以8μm效果最佳，超过10μm因切片过厚则细胞发生重叠从而使细胞收集困难，同时要注意不能使切片产生褶皱，造成切片表面与EVA膜之间存在缝隙，影响捕获效果。在HE染色步骤中，二甲苯疏松时间、组织含水量及环境湿度等均可影响捕获结果。二甲苯疏松时间不足细胞较难从周围组织分离。对环境湿度和组织含水较多者应及时更换染液，适当延长乙醇的脱水时间。但过分延长脱水时间则使组织变的干燥松脆，出现帽子与切片不能紧密接触而无法捕获。在实验过程中梯度乙醇的最长脱水时间为2min。乙烯乙酸乙烯酯膜的塑料帽(EVA caps)应置于4-10℃、干燥环境妥善保存。如帽子受潮，则激光激发能量可被乙烯乙酸乙烯酯膜大部分吸收而非穿透，致使帽子与组织接触局部温度升高，产生组织和捕获细胞灼伤。从肿瘤组织类型看，腺癌的捕获收集成功率最高，可以达到91%;鳞癌相对较差，可能与鳞癌多有癌巢及角化珠形成、癌细胞与间质结合较为致密有关。考虑到正常肺泡及支气管上皮细胞体积相对较小、细胞分布相对稀疏，故正常对照组应多捕获约10个帽子，以保证病例和对照之间可溶性蛋白总量的均衡性。在所有蛋白质组学实验中，标本处理时间都是有严格要求的[9]。一般认为，组织标本超过30-40min常温暴露往往造成细胞内蛋白质大量降解而影响检测结果。在本实验中，我们使用改良的HE染色方法，较标准方法时间缩短14min，明显减少组织暴露时间。但从染色效果看，该方法对细胞核染色效果不佳、核浆的对比度较差;而且在腺癌染色效果与鳞癌和正常组织有所不同，其原因有待深入研究。有学者在乳腺癌等实体瘤标本中使用苏木精单染，其染色时间在30s[10]。我们在预实验中使用该方法发现，尽管用苏木精染色后时间可缩短，避免蛋白质降解，但随着捕获时间的延长，切片染色加深，导致细胞和间质不能很好区分，影响捕获效果。在LCM操作过程中将捕获时间控制在40min内，按照统一标准：Duration 15.5s的激光脉冲频率和平均8000 shots计算，既可保证每个帽子的细胞收集数量，也能够将实验时间尽可能缩短，从而使实验可控性提高使操作过程标准化。当然，从质谱分析的角度出发，通过LCM获取细胞的数量较小是该方法不可避免的缺陷[11]。因此，在后续实验中，选择适当的质谱方法应当慎重考虑。
【参考文献】
[1]Posadas EM, Simpkins F, Liotta LA, et al. Proteomic analysis for the early detection and rational treatment of cancerrealistic hope? [J]. Ann Oncol, 2005, 16:1622.
[2]EmmertBuck MR, Bonner RF, Smith PD, et al. Laser capt 上一页 [1] [2] [3] [4] 下一页
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