组织及其他可能影响结果分析的杂质成分[2]。本研究应用LCM针对不同类型组织标本，选择性获取同质肺癌细胞和配对正常细胞，以期探讨该方法在肺癌研究中的技术参数和操作流程。
1 材料与方法
1.1 标本的收集及制备 收集西安交通大学医学院第二附属医院胸外科、陕西省人民医院胸心外科及陕西省肿瘤医院胸外科2005-2006年经病理诊断证实的手术切除肿瘤标本12例，其中肺鳞癌6例，肺腺癌6例。正常对照组织为同一患者正常肺组织。12例患者中男性8例，女性4例;有吸烟史者5人，平均吸烟指数1900支/年;肿瘤分期：Ⅰ期2例、Ⅱ期7例(Ⅱ A3例，Ⅱ B4例)、Ⅲ期3例。所有病例标本均在手术室采集，具体操作如下：待组织标本离体后立即切取肿瘤组织，同时切取正常对照组织;4℃冰盐水冲洗3-5次，将血液冲净，均匀分割成0.2cm×0.2cm×0.2cm组织块，分装于标志清楚的0.5mL离心管中;先置液氮中速冻，后置于-80℃冰箱保存备用。整个标本采集过程耗时控制于30min内。
1.2 试剂和仪器 苏木精、伊红、无水乙醇、二甲苯、尿素等均为国产分析纯。组织包埋剂(OTC)，冰冻切片机(Microm，HM500)，超低温冰箱(Thermo Forma -86℃)，Pixcell显微激光切割系统(Arcturus, USA)及乙烯乙酸乙烯酯膜帽子细胞收集器(EVA LCM Caps)。
1.3 方法
1.3.1 冰冻切片的制备及染色 预处理载玻片(将普通载玻片清洗干净，流水冲洗后泡酸过夜，双蒸水冲洗干净，60℃烘干备用)。取0.2cm×0.2cm×0.2cm大小组织两块，OTC包埋，待组织包埋固定完全，将切片机箱内温度设置为-25℃进行切片，切片厚度8μm，每次连续制作15张切片，-80℃保存备用。两组肿瘤组织和对照各6例，每例患者制作切片15张，进行HE染色，方法如下：苏木精10s，捞片置于冰水冲洗10s，伊红15s，85%、95%(体积分数)乙醇各20s，无水乙醇2min，2次，二甲苯Ⅰ 2min，二甲苯Ⅱ 2min。上述染色过程在冰盒中进行，染液温度控制于4-10℃，总时间控制在10min以内。完毕后进行激光捕获。
1.3.2 激光捕获 将染色完好切片置于Pixcell显微激光切割系统10×10倍目镜直视观察，重点观察细胞形态和染色情况。找到细胞密集、形态较好、染色满意区域，装载细胞收集器;在10×20倍目镜下调节监视器，按照如下条件：Power 100mV、Duration 15.5s、Spots size 15.5μm、Current 8.0mA，每张切片平均8000 shots条件进行捕获。总捕获时间不超过40min。
2 结果
切片按照改良的HE方法染色后，均能获得细胞形态完整、对比度好、肿瘤细胞和间质可清楚区分的合格切片。在设定捕获条件下，每张切片捕获后能够将90%以上的细胞收集，细胞同质性高(图1)。按照理论测算，每个shots可以捕获4-6个细胞，即每个帽子收集装置可以获得25000-30000个细胞数。总体捕获结果见表1。
表1 不同组织标本显微切割结果(略)
Table 1 Effects of microdissection in each group(n=6)
图1 激光捕获不同组织细胞及捕获细胞同质性显示(略)
Fig.1 Examples of laser capture microdissected in different tissues HE×100
A: heterogeneity of cells after microdissection; B: matched normal tissues after microdissection; C: squamous cell carcinoma tissues after microdissection; D: adenocarcinoma tissues after microdissection
3 讨论
肺脏是一个开放器官，容易受到外界污染，加之肺癌组织含有较多间质细胞而且容易坏死，因此，按照传统方法进行组织块研磨提取总蛋白进行分析，结果难免会受到杂质蛋白的影响。LCM技术现已成为蛋白质组学研究中获得纯化的目的细胞的理想工具，其在实体瘤研究中应用较多，技术方法亦日臻成熟[35]。但据文献报道，该方法主要用于核酸分子以及染色体研究，在肺癌组织蛋白组学研究领域鲜见[6]。本研究应用LCM技术切割
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