肺组织灌注前后双向电泳的比较

　　1.2.5 二向SDS PAGE电泳 采用Ettan DaltⅡ电泳系统，PAGE胶浓度为14%T, 3%C。参数设置为5W/gel运行30min;然后25W/gel运行4h，直至溴酚蓝至底边约1cm处停止。

　　1.2.6 硝酸银染色 银染在Hoefor凝胶自动染色仪上进行。固定液(500mL/L无水乙醇，100mL/L冰醋酸)固定1h;更换增敏液(300mL/L无水乙醇，2.5mL/L戊二醛，2g/L硫代硫酸钠和68g/L无水醋酸钠)30min;去离子水洗3次，每次5min;加入25g/L硝酸银溶液(含0.2mL/L甲醛)避光反应20min;加显色液(25g/L无水碳酸钠和0.1mL/L甲醛)3-10min;最后加入终止液(14.6g/L乙二胺四乙酸二钠)，10min后终止反应。以上各步骤在20℃振荡下进行。

　　1.2.7 扫描和图象分析 分别选取对照组和实验组的2D胶各3张，采用ImageScanner扫描仪，应用ImageLabScan软件，以300bpi分辨率扫描2D胶。用ImageMaster 2D Elite 3.01图象分析软件进行点检测，背景消减，二维校正等，以确定蛋白点的差异。

　　1.2.8 信息学分析 登陆http://ca.expasy.org/ch2d/网站，检索SWISS2DPAGE数据库，将本实验得到的2D胶与血浆和红细胞的2D胶图谱分别进行比对，采用生物信息学方法确认2D胶上的高丰度蛋白点是何种性质蛋白。

　　1.2.9 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件分析，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异显著。

　　2 结 果

　　2.1 双向电泳图分析 信息学分析结果提示对照组3张2D胶上的高丰度蛋白点主要为血浆中的白蛋白、转铁蛋白和红细胞的血红蛋白α链和β链成分，由于这些无意义高丰度蛋白的存在，使得真正肺组织的蛋白难以在2D胶上显示。与此形成鲜明对照的是灌注组3张2D胶的上述高丰度蛋白显著减少，从而肺组织的蛋白点相应增加，蛋白点比较锐利(图1)。图1 肺组织的双向电泳图(略)

　　2.2 蛋白分布特点比较 对照组的蛋白点计数为1095±5，灌注组的蛋白点计数为1569±10。在分子量30-70ku范围内，灌注组的蛋白点计数显著高于对照组(P<0.01)，在其他分子量范围内二者蛋白点计数无显著性差异(图2)。图2 不同分子量的肺组织蛋白分布(略)。在pH值5-8和9-10范围内，灌注组的蛋白点计数显著高于对照组(P<0.01)，在其他pH值范围内二者蛋白点计数无显著性差异(图3)。图3 不同等电点的肺组织蛋白分布(略)

　　3 讨 论

　　肺栓塞的动物模型分为两类：一类是药物引起的肺部弥漫性微血栓;另一类是各种栓子引起的肺部大血管堵塞。我们采用的是第二类肺栓塞动物模型，因为这种模型更接近临床实际情况。实验证明，采用颈静脉插管，生理盐水灌注的方法，可以有效地去除肺组织内的血液成分，使肺组织蛋白能够更好地在2D胶上展示。首先，对照组2D胶上出现的高丰度血液蛋白成分，如：白蛋白、转铁蛋白及红细胞的血红蛋白α链和β链等，在灌注组2D胶上显著减少，相应的增加了肺组织中低丰度蛋白的上样量。其次，灌注组2D胶上的肺组织蛋白成分相应增加，表现为蛋白点计数的提高。对照组的蛋白点计数为1095±5，灌注组的蛋白点计数为1569±10。在分子量30-70ku范围内，灌注组的蛋白点计数显著高于对照组(P<0.01)，在其他分子量范围内二者蛋白点计数无显著性差异。在pH值5-8和9-10范围内，灌注组的蛋白点计数显著高于对照组(P<0.01)，在其他pH范围内二者蛋白点计数无显著性差异。

　　需要注意的是在对肺组织进行生理盐水灌注时，需要严格控制生理盐水的量和灌注时间。生理盐水量不足，使血液成分得不到有效置换;灌注时间过长，会使肺组织蛋白分解。本实验每只大鼠的生理盐水用量为500mL，采用加压输注的方法，使灌注时间控制在5min内，既可有效去除血液成分，也可防止蛋白分解。

　　参考文献：

　　[1]Sam H. Disease proteomics . Nature, 2003, 422(2): 226232.

　　[2]Eric P, Philippe IHB, Zhu H, et al. Protein analysis on a proteomic scale . Na

上一页  [1] [2] [3] [4] 下一页