肺组织灌注前后双向电泳的比较

　　KEY WORDS: 2dimensional electrophoresis; lung tissue; perfusion

　　蛋白质组学是继基因组学之后飞速发展的一个学科。比较蛋白质组学在研究疾病的发生、发展和转归，寻找疾病特异性的诊断指标和药靶方面发挥着越来越重要的作用。双向电泳技术是一种先进的蛋白展示技术，是蛋白质组学的重要研究方法之一。目前，在呼吸系统疾病的研究中，双向电泳技术多用于肺部肿瘤细胞系、肿瘤组织、肺泡灌洗液的研究。但该技术用于展示栓塞肺组织的蛋白仍未见报道，究其原因，主要是海绵样的肺实质中充斥着大量的血液成分。这些血液成分(蛋白)，如血浆白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白和血红蛋白等，在蛋白提取过程中混杂于肺组织蛋白中，由于这些蛋白均为高丰度蛋白，不但会在2D胶上掩盖肺组织蛋白，而且也会使肺组织的低丰度蛋白难以显示。为了克服这一难题，我们希望摸索出一套技术路线，能够利用双向电泳技术更好地展示肺组织蛋白，获得更多的生物学信息。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 二硫苏糖醇(DTT)、尿素(Urea)、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸(glycine)、琼脂糖(agarose)、甘油(glycerol)、溴酚蓝(bromophenol blue)、3(3胆胺丙基)二甲氨基1丙磺酸(CHAPS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、两性电解质(CA)、丙烯酰胺(acrylamide)、甲叉丙烯酰胺(N,Nmethylene bisacrylamide)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、碘乙酰胺(iodoacetamide)、四乙基乙二胺(TEMED)、低分子质量标准蛋白、IPG缓冲液、IPG覆盖液和IPG干胶条(3-10NL和3-10L，18cm)均购自Amersham Pharmacia公司，考马斯亮蓝R250购自Amresco公司，双向电泳所有溶液均用MilliQ水配制。紫外分光光度计UV330购自英国Unicam公司，IPGphorTM等电聚焦仪、Ettan DaltⅡ电泳设备、Hoefor凝胶自动染色仪、ImageScanner扫描仪、ImageMaster 2D Elite 3.10图象分析软件均购自Amersham Pharmacia公司。雄性Wistar大鼠购自解放军军事医学科学院实验动物中心。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠肺组织的提取 取雄性Wistar大鼠6只，每只体重约300g，随机分为2组，即对照组和灌注组各3只。将灌注组大鼠用10g/L戊巴比妥0.1mL麻醉，分离一侧的颈总静脉和颈总动脉。结扎颈总静脉远端，插入输液管，结扎固定，剪断颈总动脉的同时打开输液器，快速加压输注生理盐水500mL。迅速开胸，取出肺组织，用生理盐水反复冲洗，-80℃冻存。对照组可直接将大鼠麻醉后取肺组织。

　　1.2.2 肺组织蛋白的提取 采用三氯醋酸/丙酮沉淀法提取肺组织蛋白。首先将肺组织剪碎，然后加入含DTT(2g/L)的100g/L三氯醋酸的丙酮溶液中进行机械匀浆;-20℃沉淀过夜;用含2g/L DTT的预冷丙酮反复洗涤沉淀，最后在通风橱中使丙酮挥发。在沉淀中加入裂解液(9mol/L Urea，40g/L CHAPS，10g/L DTT，5mL/L CA，1mmol/L EDTA，35mg/L PMSF，0.7mg/L抑肽素，0.5mg/L亮肽素)，15℃，40000×g，离心1h，取上清。用Bradford法对上清进行蛋白定量，分装后-80℃保存。

　　1.2.3 一向等电聚焦 对照组采用18cm pH3-10NL胶条，灌注组采用18cm pH3-10NL胶条。肺组织蛋白1mg(考染检测)与再水合液(8mol/L Urea, 20g/LCHAPS，痕量溴酚蓝，临用前加入20mmol/L DTT和5mL/L IPG Buffer)充分混合，总体积为350μL。一向等电聚焦在IPGphor等电聚焦仪上进行，参数设置为30V 再水合12h;200V，1h;500V，1h;1000V，1h;8000V，逐渐升压30min，最后维持在8000V，总计聚焦功率达到50000伏小时。

　　1.2.4 胶条平衡 等电聚焦结束后，将胶条先后在平衡液Ⅰ(6mol/L Urea，300mL/L Glycerol，20g/L SDS，50mmol/L TrisHCl，pH8.8，痕量溴酚蓝, 临用前加入

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