DNA含量及S期细胞比值与肺癌生物学特性的关系

　　KEY WORD: lung cancer; flow cytometry; DNA content; biological characteristic

　　恶性肿瘤的染色体变化是肿瘤的基本生物学特征之一。研究表明，人类大多数肿瘤细胞的染色体都有异常，表现为染色体结构和数目的异常。异倍体的出现是恶性肿瘤的特征之一[12] 。在细胞恶变过程中因染色体的畸变使细胞DNA含量发生改变，其在肿瘤的发生、发展、转移和预后中均具有重要意义。本研究对56例肺癌及36例肺非癌性病变的新鲜组织进行流式细胞仪(FCM)DNA含量、S期细胞比值(Sphase fraction, SPF)测定，并分析DNA含量、SPF与肺癌临床病理指标的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 观察对象 选择2002年3月至2002年12月在我院手术切除和经纤支镜活检的肺癌标本共56例(手术切除的肺癌标本15例，经纤支镜活检的肺癌标本41例)，其中男性44例，女性12例。年龄30-78岁，平均55岁。病理类型：鳞癌33例、腺癌11例、小细胞癌12例。术前均未行任何放、化疗。TNM分期：Ⅰ期2例、Ⅱ期20例、Ⅲ期23例、Ⅳ期11例。36例非癌性病变(手术切除标本15例，经纤支镜活检标本21例)，其中男性17例，女性19例。年龄13-69岁，平均46岁。均经病理检查证实为非癌性病变，其中符合结核肉芽肿10例，血管瘤2例，炎性假瘤6例，支气管黏膜慢性炎15例，鳞状化生2例，黏膜急性炎1例。

　　1.2 主要仪器与试剂 OLMPUS BP40纤支镜(日本)，OLMPUS CLEIU冷光源(日本)，FACScalibur流式细胞仪(美国BD公司)，分析用 Macintosh计算机(美国苹果公司)，Allegra 21R台式低温离心机(美国Coulter公司)。PBS缓冲液(美国Beckmancoulter公司)，组织培养液(美国BD公司)，溶血素(美国BD公司)，DNA试剂盒(美国BD公司)。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 样本制备 由手术切除和经纤支镜活检的新鲜标本约0.5g，立即置培养液中4℃冰箱保存，于1h内制成单细胞悬液(flow cytometry, FCM)备DNA检测。所有患者同时同部位另取标本置10%(体积分数)甲醛溶液中固定送病理检查。

　　1.3.2 流式细胞术DNA含量及细胞周期分析 将手术或纤支镜所取标本离体后立即置2mL培养液中，将组织用锐利的剪刀切碎至1mm大小，放在180目铜网上轻搓，边搓边以PBS液缓慢冲下，收集细胞悬液，以1000r/min离心沉淀5min，去上清液，加入溶血素2mL作用10min，PBS漂洗2次，离心沉淀(1000r/min，5min)，弃上清液，加入95%(体积分数)冰乙醇，配成终浓度为70%的细胞悬液固定，置4℃冰箱待检。测定前用PBS洗涤3次，弃上清液，加入A溶液250μL(内含30mg/L胰蛋白酶)混匀后静置10min，再加入B溶液(内含100mg/L Rnase A)200μL，混匀后静置10min，最后加入C溶液200μL，混匀后避光静置10min，调整细胞浓度为1×106，上机检测。使用流式细胞仪进行样本检测，测定前使用标准微球校准仪器的CV值在3以内。

　　1.3.3 分析指标 以DNA指数(DI值)表示DNA含量，依据DI值判定DNA倍体，0.9≤DI≤1.1 为DNA二倍体;DI<0.9或>1.1为异倍体。DNA异倍体的判定：在DNA直方图上出现明显的两个峰且异倍体细胞群至少应含5%-10%的细胞或核同时DI<0.9或DI>1.1。同时测定SPF。

　　DI=肿瘤细胞G0/G1峰道数/正常二倍体细胞G0/G1峰道数

　　SPF(%)=[S÷(G0/G1+S+G2M)]×100%

　　1.3.4 病理切片的制备 以常规石蜡切片程序制片，HE染色,由病理诊断医师按照WHO肺癌国际组织学分类标准,对肺癌的细胞类型、分化进行分类。

　　1.4 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理，两样本均数间比较采用t检验，两样本率间比较采用χ2检验。相关

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