维生素C对硼替佐米诱导多发性骨髓瘤细胞株KM 3凋亡作用的影响

　　2.2.3 线粒体跨膜电位变化 硼替佐米处理组24 h后△ψM检测显示△ψM降低，绿色荧光细胞比率重复3次为(11.32±1.86)%(图4A)，高于硼替佐米+维生素C处理组(5.1±0.91)%(P<0.01)(图4B)。对照组为(4.6±0.98)%(图4C)。维生素C组为3.6±0.84%(图4D)。

　　2.2.4 Caspase-3 活性 硼替佐米处理组16 h后3个平行组产生的pNA为25.21±0.349 μmol。 硼替佐米+维生素C处理组为21.79±0.198 μmol，低于硼替佐米组(P<0.01)。对照组为20.67±0.156 μmol，维生素C组为20.12±0.17 μmol。

　　2.2.5 活性氧水平变化 18 h后平均荧光强度硼替佐米+维生素C处理组为30.2±1.96(图5A)低于硼替佐米处理组为52.23±1.9(图5B)(P<0.01);对照组为28.4±1.87(图5C);维生素C组为21.3±1.6(图5D)低于对照组(P<0.01)。

　　3　讨　论

　　维生素C是具有许多生物学功能水溶性的葡萄糖类物质。Sestili等[5]认为高剂量维生素C有亲氧化作用，低剂量有抗氧化作用。维生素C既能防止化疗药物对肿瘤及正常组织的损伤[6]，又能协同化疗药物诱导肿瘤细胞的凋亡[7]。体外细胞培养实验表明，低浓度的维生素C(4 mmol/L)对SW620纤维瘤细胞有保护作用，而高剂量(>20 mmol/L)对细胞有杀伤作用[8]。

　　本实验中Annexin V/PI分析显示加入维生素C后，细胞早期凋亡率明显下降。硼替佐米处理24 h后细胞呈典型凋亡改变，加入维生素C后细胞形态大体正常。所以认为维生素C在较低浓度(80 μmol/L)下有抑制硼替佐米对KM-3凋亡的诱导作用。

　　诱导细胞凋亡有3种信号通路： 死亡受体信号通路、线粒体信号通路和内质网信号通路， 目前认为线粒体途径在凋亡过程发挥枢纽作用[9]。氧化刺激、Ca2+过量摄取等诱导因素导致的细胞凋亡，都有线粒体跨膜电位消失。因而线粒体跨膜电位的消失标志着一个不可逆转的凋亡过程。实验中发现加入维生素C后线粒体膜电位崩溃的绿色荧光细胞比率较硼替佐米处理组显著降低。

　　Caspase蛋白酶家族是引起细胞凋亡的关键酶，实验显示KM-3细胞经硼替佐米作用16 h后pNA产生增加Caspase-3活性较对照升高，加入维生素C后pNA产生减少，酶活性下降。

　　正常情况下NF-κB是一种核转录因子，在细胞质中与抑制剂I-κB相互作用形成复合体，防止NF-κB进入核内，NF-κB介导的转录作用被阻断;一旦I-κB磷酸化与NF-κB解离，NF-κB进入核内诱导抗凋亡蛋白的合成，细胞增生并表达黏附分子导致细胞增生、存活;而在MM瘤细胞中NF-κB组成性激活，导致瘤细胞不断增生。如果I-κB在蛋白酶体内降解受抑制，NF-κB停留在细胞质内，功能受抑制，失去抗凋亡效应和刺激细胞增生作用[10-11]。目前认为这是硼替佐米的主要作用机制，但硼替佐米并不仅仅通过抑制该通路发挥作用，还存在其他作用机制。

　　活性氧是细胞凋亡的信号之一，活性氧的产生可直接或间接改变线粒体膜电位，促进CytC从线粒体内释放，启动线粒体信号通路[12]。陈丽娟等[13]研究发现硼替佐米可改变多发性骨髓瘤U266细胞株内氧化还原状态，导致线粒体和内质网产生活性氧增多，从而诱导U266细胞凋亡。由此推测，线粒体途径参与了硼替佐米诱导的多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡。

　　实验中用DCFHDA作为荧光探针测定细胞内活性氧水平时，发现维生素C降低了硼替佐米产生的活性氧水平，降低了无诱导因素作用的对照组细胞活性氧水平。因而认为维生素C能清除胞内活性氧，正是该作用降低硼替佐米诱发的活性氧水平，阻止了线粒体膜电位的崩溃。

　　本实验探讨了维生素C在体外环境、低浓度下对硼替佐米作用影响，至于高浓度及体内条件下的作用需进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] Hideshima T，Chauhan D，Richardson P，et al.NF-kappa B as a therapeutic target in multiple myeloma[J]. J Biol Chem， 2002，277(19):16639-16647.

　　[2] Hideshima T，Mitsiades C，Akiyama M，et al.Molecular

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