维生素C对硼替佐米诱导多发性骨髓瘤细胞株KM 3凋亡作用的影响

　　1.2 WST-1法检测生长抑制率 WST-1(碧云天生物技术研究所产品)在电子耦合剂存在的情况下，被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深;细胞毒性越大，则颜色越浅。在450 nm处有吸收峰，生长抑制率如下公式计算：

　　细胞生长抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%

　　1.3 形态学观察 细胞收集至载玻片，用瑞氏染液染色并置于光学显微镜下观察。

　　1.4 Annexin-V分析 使用FITC标记的Annexin-V和PI双染法检测细胞凋亡，根据晶美生物工程有限公司提供的说明书进行操作。即取(5~10)万个细胞，经4 ℃ PBS漂洗2次，弃上清，加入250 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞。取100 μl移入流式细胞仪专用试管，加入5 μl Annexin V-FITC、10 μl碘化丙啶染色液轻轻混匀。室温(20~25 ℃)避光孵育15分钟。加入400 μl PBS轻轻混匀，用流式细胞仪进行分析。

　　1.5 线粒体跨膜电位(Δψm)检测 JC-1(碧云天生物生物技术研究所产品)在线粒体膜电位较高时聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。取(10~60)万细胞，重悬于0.5 ml细胞培养液中，加入0.5 ml JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37 ℃孵育20分钟。600 g 4 ℃离心3~4分钟，沉淀细胞，弃上清，用冰浴的JC-1染色缓冲液洗涤2次，再用0.4 ml JC-1染色缓冲液重悬后，用流式细胞仪分析。

　　1.6 Caspase 3活性检测 Caspase 3可以催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA，pNA在405 nm附近有强吸收，通过测定pNA吸光度来检测Caspase 3的活性。根据碧云天生物生物技术研究所产品说明操作。600 g 4 ℃离心5分钟收集细胞， PBS洗涤1次。取200万细胞加入100 μl裂解液，冰浴裂解15分钟。4 ℃ 16 000~20 000 g离心10~15分钟，把上清转移到冰浴预冷的离心管中。取出10 μl加入反应体系37 ℃温育出现变色后，于405 nm测吸光度。对照标准曲线确定pNA量。

　　1.7 活性氧检测 DCFHDA(碧云天生物生物技术研究所产品)自由扩散进入细胞后被酯酶催化生成DCFH，DCFH不能通透细胞膜，在活性氧存在下被氧化成DCF，DCF荧光强度与细胞内活性氧水平呈正比。DCF的激发波长为488 nm，吸收波长为525 nm。收集一百万细胞悬浮于1∶5 000无血清培养液稀释的1 ml DCFH-DA中，37 ℃细胞培养箱内孵育20分钟。用PBS洗涤细胞3次，加入200 μl PBS，用流式细胞仪检测一万个细胞。

　　2 结 果

　　2.1 硼替佐米、硼替佐米+维生素C对KM-3细胞的抑制作用 KM-3细胞经10、25、50、75 nmol/L浓度的硼替佐米处理24 h后生长抑制率的3次均值分别为40.83%、44.9%、51.2%和55.17%，48 h分别为45.9%、58.7%、71.2%和78.1%。根据48 h半数抑制浓度选择药物作用浓度，因此选择硼替佐米15 nmol /L 作为药物处理浓度。再将KM-3细胞经硼替佐米15 nmol/L+维生素C 10、20、40、80 μmol/L作用24、48 h计算细胞生长抑制率3次均值分别为23.65%、11.1%、7.53%、4.3%;20.3%、9.8%、6.36%、3.40%(图1)。选择80 μmol/L作为维生素C处理浓度。

　　2.2 维生素C对硼替佐米诱导KM-3细胞凋亡作用的影响

　　2.2.1 细胞形态学改变 收集细胞涂片，瑞氏染色后光学显微镜下观察对照组和维生素C组细胞形态正常(图2A、2B)。硼替佐米+维生素C处理组细胞形态正常，偶见凋亡细胞(图2C)。硼替佐米处理组可见胞膜皱缩、染色质凝集、边缘化、胞质起泡(图2D)。

　　2.2.2 Annexin V 分析 24 hAnnexin V FITC / PI双标结果显示，硼替佐米处理组凋亡细胞比例重复3次为(16.3±1.95)%(图3A)，硼替佐米+维生素C组为(8.46±0.89)%(图3B)，低于硼替佐米处理组(P<0.01)。对照组为(5.41±1.3)%(图3C)。维生素C组为(4.9±1.4)%(图3D)。

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