【关键词】 大肠癌 bcl2 bax 丹皮酚
化疗药物的耐药[1]及其毒副作用一直是大肠癌治疗的两大难题，因此在植物中寻找有效且副作用小的抗肿瘤药物已成为国内外重要的研究课题。研究表明，丹皮酚(Paeonol,Pae)具有一定的抗肿瘤活性，灌胃给药有抗小鼠肝肿瘤作用[2]。我们已报道Pae在体外能显著抑制人大肠癌HT29细胞的增殖[3]。为进一步探索这种抑制作用的可能机制，我们进行了以下研究，为Pae的临床应用提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
常规培养HT29细胞，取对数生长期细胞用于实验。细胞分为实验组和对照组，其中实验组分别加入不同浓度的Pae溶液(分别为15.63mg/L、62.5mg/L、250mg/L)，对照组加入等量培养液。
1.2 Pae诱导细胞凋亡的研究
1.2.1 倒置显微镜下观察 常规培养瓶内培养HT29细胞，倒置显微镜下连续性动态观察细胞生长情况。
1.2.2 TUNEL法检测细胞凋亡 细胞接种于置有盖玻片的6孔培养板中,贴壁后分为实验组和对照组, 48h后取出盖玻片，按TUNEL试剂盒说明进行处理。光镜下观测，胞核染色呈棕褐色被判为凋亡细胞，随机选取5个高倍镜(×200)视野，每个视野计数200个细胞，凋亡指数 (AI) = 凋亡细胞数/总细胞数×100%。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期 消化收集各实验组及对照组培养48h的细胞，离心、漂洗、过滤、固定，加入RNase及PI染色，上机检测。
1.3 凋亡相关基因bcl2、bax的检测
细胞接种及分组同TUNEL法，48h后漂洗、固定，滴加一抗(bcl2、bax抗体)，以PBS代替一抗作为阴性对照，余步骤按SP试剂盒操作说明进行。每张玻片在40×10高倍显微镜下观察，细胞染色呈棕褐色被判为阳性细胞,不染为阴性细胞。凋亡相关基因蛋白bcl2、bax定位于胞浆和胞膜。每个视野下分别计算：表达率(%)= (阳性细胞数/细胞总数)×100%，每张涂片观察5个视野。
1.4 统计学处理
使用SPSS10.0统计软件。
2 结果
2.1 Pae对HT29细胞凋亡的诱导作用
2.1.1 倒置显微镜下观察 对照组细胞生长旺盛，呈高折光率，胞体大。Pae组细胞增殖减慢，随着药物浓度增大和时间延长，细胞逐渐变小、折光率减弱，部分脱落漂浮于培养瓶中，但细胞膜完整，最后裂解。
2.1.2 TUNEL法 实验组凋亡细胞的棕褐色染色颗粒定位于细胞核内，染色阳性的细胞出现细胞核碎裂，核质固缩，细胞膜突出形成质膜小泡等凋亡细胞形态学变化(图略)。经Pae处理48h， HT29细胞株的凋亡细胞数明显增加，差异均有显著性(P<0.01)，且AI与Pae浓度呈正相依赖关系，见表1。表1 各组凋亡指数的比较
2.1.3 流式细胞仪检测 不同浓度的Pae作用于HT29细胞48h后，细胞周期分布发生明显改变，表现为S期细胞比例上升，G0/G1期和G2/M期细胞比例下降，见表2，并出现明显的凋亡峰，见图1a～1d。两组结果相比差异均有显著性(P<0.05)。
2.2 Pae对凋亡相关基因bcl2、bax表达的影响 见表3。表2 Pae对HT29细胞周期的影响
2.2.1 bcl2蛋白表达 对照组的bcl2蛋白表达水平最高，胞浆染色细胞数最多并且呈深棕色，Pae组细胞bcl2表达均有下降，染色阳性细胞减少，染色明显变浅，且与药物浓度呈反比关系，各组结果与对照组相比均具有显著性差异(P<0.01)(图略)。
2.2.2 bax蛋白表达 阳性细胞胞浆、胞膜染成深棕色。Pae组染色阳性细胞数及染色程度与对照组相比无显著性差异(P>0.05) (图略)。
3 讨论
细胞增殖过盛和凋亡抑制被认为是肿瘤发生、发展的关键[4]。众多研究业已表明，细胞凋亡的减少与大肠癌的发生、发展相关。多种化疗药物均可引起肿瘤细胞凋亡[5]。通过诱导凋亡治疗肿瘤是目前的一个热点[6]。本实验中Pae作用于大肠癌HT29细胞，通过光镜可观察到典型的凋亡细胞形态学改变。TUNEL法发现经Pae处理后大肠癌细胞的凋亡指数显著提高，且与Pae呈剂量依赖关系。流式细胞仪发现Pae作用后出现了明显的凋亡峰，细胞周期分布也发生了明显
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