蛋白激酶C参与脂多糖诱导肺微血管内皮细胞VEGF表达

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠肺微血管内皮细胞分离培养和处理 大鼠肺微血管内皮细胞的分离,培养参照Chen等的方法[3]，将新生1 d的SD仔鼠处死，乙醇浸泡消毒5 min，取出肺组织用PBS冲洗，将肺的周边切割成1 mm×1 mm×1 mm大小组织块，用吸管将组织块均匀放置在培养瓶内，间距约1 cm。加入含10%胎牛血清、105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基，放入37 ℃、含5%CO2、湿度为95%～100%的孵箱内，静置培养60 h后去除组织块。3～4 d更换1次培养液。第1～2周80%～90%细胞单层汇合时，用0.5%胰蛋白酶消化后按1∶3传代。实验用2～5代细胞。相差显微镜下，细胞呈典型的铺路石状排列，采用CD31抗原间接免疫荧光染色进行鉴定。实验开始前细胞无血清培养24 h。实验细胞分为：(1)正常对照组和用不同浓度LPS刺激内皮细胞24 h，分别测定VEGF mRNA和蛋白的表达;(2)正常对照组和100 ng/ml LPS刺激内皮细胞6 h、12 h、24 h、36 h和48 h，分别测定VEGF mRNA和蛋白的表达;(3)正常对照组和用终浓度分别为0.01~1 μmol/L的calphostin c预处理内皮细胞30 min后，用LPS刺激内皮细胞24 h，分别测定VEGF mRNA和蛋白的表达。

　　1.2.2 RT-PCR 应用Trizol Reagent从各组内皮细胞中提取总RNA。以Oligo (dT) 为引物,遵循RNA逆转录试剂盒操作步骤合成dscDNA。根据VEGF(Genebank: AF062644)基因序列,用primer premier软件设计的PCR 反应体系中的上下游引物,分别为：

　　上游引物为:5 - CACATAGGAGAGATGAGCTTC-3′

　　下游引物为:5 -TCGTCACCGTCGACAGAACAG -3′

　　扩增产物400 bp, GAPDH上下游引物分别为：

　　上游引物为:5 -GAAACTACCTTCAAC TCCATC-3

　　下游引物为:5 -GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3

　　扩增产物250 bp，以逆转录反应的产物dscDNA 为模板进行扩增，反应参数为:94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共25 循环，最后于72 ℃继续保温5 min，反应产物以1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。反应结束后,取PCR 反应液(10 μl) 进行琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪上观察结果。

　　1.2.3 Western Blot 细胞培养至相应的时间后弃去培养液提取蛋白并用改良Lowry法进行蛋白定量，从相应蛋白样品中取等量的蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离的蛋白质转印至PVDF膜后，在5%脱脂奶粉封闭液中室温封闭1 h。随后以抗VEGF(1∶1000稀释)孵育过夜。1×PBST洗涤3次后加入相应的二抗孵育2 h。洗涤后以ECL检测，通过X胶片感光而获得蛋白信号。β-actin作为内参。

　　2 结 果

　　2.1 LPS诱导内皮细胞VEGF的表达

　　2.1.1 LPS诱导内皮细胞VEGF表达的剂量依赖性

　　不同剂量LPS刺激内皮细胞24 h后，随着LPS剂量的升高，VEGF mRNA表达的相对量亦逐渐升高(图1A)。10、100、1000 ng/ml LPS处理组VEGF mRNA表达量高于对照组。VEGF蛋白质表达变化与mRNA表达变化相一致，LPS上调VEGF蛋白表达呈时间依赖关系(图1B)。

　　2.1.2 LPS诱导内皮细胞VEGF表达的时间依赖性

　　100 ng/ml LPS刺激内皮细胞后，VEGF mRNA表达相对量逐渐升高，LPS 24 h处理组VEGF mRNA表达量达到峰值(图2A);LPS 刺激36 h后VEGF mRNA表达相对值开始下降。VEGF蛋白质表达变化与mRNA表达变化相一致，LPS上调VEGF蛋白表达呈时间依赖关系(图2B)。

　　2.2 PKC参与LPS诱导内皮细胞VEGF的表达 用0.01~1 μmol/L calphostin C预处理内皮细胞，其以剂量依赖的方式抑制LPS所诱导的VEGF mRNA和蛋白质表达增加，这提示LPS通过调节PKC信号通路而调节VEGF表达增加(图3)。