】 COPD; TNFA; LTAgene
慢性炎症是慢性阻塞性肺病(COPD)发病过程中的重要特征。参与肺部炎症调节的细胞因子在COPD发病过程中起重要作用。肿瘤坏死因子α(TNFα)是一个多功能的细胞因子，它促进气道重构，改变平滑肌细胞功能，参与肺部炎症调节，从而在COPD发病过程中起重要作用。淋巴毒素α(LTα)也是炎症细胞介素，主要由淋巴细胞合成。两种细胞因子都与细胞表面的相同受体有关系。其编码两种细胞因子TNFA和LTA基因彼此连锁并位于6号染色体短臂(6p21.16p21.3)主要组织相容性复合体簇范围内。关于TNFA和LTA基因不同等位基因变异是否影响TNFα和LTα表达水平尚有争议。已证明与G等位基因比较，A等位基因与细胞因子产物成倍增高有关〔1，2〕。在亚洲某些群体发现TNFA基因的A等位基因与某些呼吸系统疾病表型关联，而在欧洲群体迄今未得到证实。LTA基因第一内含子+252A/G多态性对肺部疾病的作用研究很少。本文旨在探讨TNFA和LTA基因等位基因变异与COPD的相关性。
1 对象与方法
1.1 对象
所有COPD患者均为中国北方汉族人，病例组选取2004年12月～2006年2月本院呼吸科住院的COPD患者50例，诊断符合慢性阻塞性肺疾病诊治指南〔3〕，年龄58～83(平均62.41±13.38)岁。对照组选取同期本院健康体检者，年龄56～79(平均58.92±12.53)岁，X线胸片和肺功能正常。同时均排除支气管哮喘、肺癌、肺间质纤维化等呼吸系统疾病及冠心病、高血压等具有遗传倾向的疾病。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取
用标准苯酚氯仿法从外周血抽提基因组DNA。
1.2.2 PCR TNFA基因
308G/A和LTA基因+252A/G的检测用聚合酶链反应限制性片段长度多态性方法。308G/A位点引物序列正向为5′AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT3′;反向为5′TCCTCCCTGCTCCGATTCCG 3′。PCR产物为107 bp。+252A/G 位点引物序列正向为5′CTCCTGCACCTGCTCCTGGATC3′;反向为GAAGAGACGTTCAGGTGGTGTCAT3′。 引物由北京鼎国生物工程有限公司合成。PCR产物为368 bp。PCR反应总体系为25 μl，包括4 μl模板基因组DNA,10×PCR缓冲液2.5 μl，Mg2+浓度2.0 mmol/L,1 mmol/L dNTPs 2.5 μl,每条引物各5 pmol/L,TaqDNA聚合酶4 U (北京鼎国)，不足体积用灭菌双蒸水补充至25 μl。TNF基因308G/A PCR反应条件：94℃预变性5 min;94℃变性60 s，61℃(LTA基因+252A/G为64℃)退火45 s，72℃延伸60 s，32个循环;最后72℃延伸7 min。扩增后取反应产物4 μl在2%琼脂糖凝胶上电泳15 min，120 V电压，紫外灯下鉴定PCR产物。
1.2.3 酶切条件及体系
采用限制性片段长度多态性检测TNFA和LTA基因的多态性。在20 μl体系中，加入10 μl PCR产物，10×缓冲液2 μl，NcoⅠ(北京鼎国)4 U(0.5 μl),不足体积用灭菌双蒸水补充，37℃孵育5～6 h。
1.2.4 TNFA和LTA基因多态性的分析
对于TNFA和LTA基因分别取酶切产物5 μl在含0.5 μg/ml溴化已锭的3%琼脂糖凝胶上电泳15～20 min，根据紫外灯下观察到的酶切产物片段长度鉴定等位基因并照相。
1.3 统计学处理
采用SPSS11.5版软件进行χ2检验。
2 结 果
2.1 TNFA和LTA基因的突变位点及突变规律
TNFA基因308G/A多态性位点PCR产物经NcoⅠ酶切后电泳结果见图1。TNFA基因PCR产物长度为107 bp,G等位基因特点是存在NcoⅠ酶切点，可被切成87和20 bp两个片段。A等位基因无NcoⅠ酶切点为107 bp一个片段。所以，在电泳后GG基因型为87和20 bp两个片段;AA基因型为107 bp一个片段;AG基因型为107、87和20 bp三个片段。LTA基因+252A/G多态性位点PCR产物经NcoⅠ酶切后电泳结果见图1。LTA基因PCR产物长度为368 bp，其中A等位基因特点是缺少NcoⅠ酶切点为368 bp
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