ACD保养液中树突状细胞的变化

　　Key words: dendritic cells; ACD solution; phagocytosis

　　树突状细胞(dendritic cell，DC)是近年来倍受人们关注的一类抗原递呈细胞(antigen presenta tion cella，APC)[1]，可把抗原特异性地提呈给淋巴细胞而产生抗原特异性细胞免疫反应。因其功能和作用独特，近年来倍受人们关注。在血液保养液中DC的生存和功能状况国内尚未见报道。为此，我们对8例正常健康献血者的血液在采集后保存的不同时间进行DC的培养增殖，以及对DC对灭活酵母菌的吞噬功能进行实验研究。现将资料报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 仪器和试剂 rhIL-4(比活性13×109 U/g)、rhTNF-α(比活性36×109 U/g)、rhIL-2(比活性40×109 U/g)为Promega公司产品，rhGM-CSF由中国军事医学科学院提供，RPMI 1640、胎牛血清为Gibico公司产品;淋巴细胞分离液(Ficoll，1.077)由上海第二制药厂提供，PE结合的鼠抗人单抗CDla、CD80及同亚型对照抗体兔鼠IgG1К为Pharmingen公司产品，FITC结合的CD14、CD86、HLA-DR和同型对照抗体FITC-mIgG1、PE-mIgG2a为BD公司提供，流式细胞仪为美国BD公司的FACSCaliar，分析软件为ELITE。

　　1.2 酵母菌悬液的制备 取鲜酵母(安琪酵母)1 g，生理盐水配成10%酵母菌悬液，1000 r/min离心5 min，洗涤3次，取上层液10 ml，沸水浴中30 min，取出后3000 r/min离心5 min，去除上清液后用生理盐水恢复同体积，1000 r/min离心5 min，取上层液备用。

　　1.3 DC的体外培养 参考文献[2]方法。抽取外周静脉血200 ml贮存，在第1、2、3、4天各分离出血液20 ml(培养用)，3000 r/min离心30 min，吸出富含白细胞层液约5 ml,用淋巴细胞分离液分离收集单个核细胞(PBMC)，PBMC用无菌生理盐水离心洗涤3次，1500 r/min离心15 min，用RPMI 1640完全培养基(内含10%胎牛血清和5%AB血清)将细胞密度调至2×109/L，加入6孔细胞培养板中，每孔3 ml，置37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h。再用预热的培养基轻洗培养板2次，洗去未黏附的细胞即获贴壁的PBMC，每孔加入完全培养基(含200 μg/L rhGM-CSF和50 μg/L rhIL-4)3 ml，每2天半量换培养基，观察DC的形态和增殖情况等。

　　1.4 观察项目 将贮存的外周静脉血于第1、2、3、4天分别进行培养后，进行如下观察。

　　1.4.1 PBMC培养前后的变化 用流式细胞仪分析 PBMC培养前和培养7天后CD1a、CD14。

　　1.4.2 细胞生长特点及形态变化 培养7天后在倒置显微镜下观察DC细胞生长情况。

　　1.4.3 吞噬试验 将培养7天的DC细胞配成1×109/L悬液与酵母菌悬液(1×1011/L)等量混合。37℃孵育1 h，取出涂片，干燥后行瑞-姬染色。观察DC吞噬酵母菌的吞噬率和吞噬指数。

　　2 结果

　　2.1 PBMC培养生长增殖情况 采血当天分离的PBMC培养生长增殖良好，第2天分离的PBMC培养7天时每孔只有少量细胞生长，第3、4天分离的PBMC培养7天时未见生长。采血当天分离的PBMC培养前和培养7天后CD1a、CD14流式细胞分析见图1。

　　图1 PBMC培养前后CD1a、CD14流式细胞分析图(略)

　　2.2 细胞生长状况及形态 新鲜分离(第1天)的PBMC在倒置显微镜下观察为分散分布，无聚集现象，

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