食管内脏高敏感性动物模型的建立和评价

　　Keywords: visceral hypersensitivity; c-fos; immunohistochemistry; esophageal acid perfusion; ovalbumin

　　慢性食管内脏高敏感性可能是某一亚类的非糜烂性反流病(NERD)发生的最重要病理生理特征，是这类患者症状产生的基础和症状多样化的原因[1-2]。目前，尚不清楚中枢神经系统(CNS)中哪些核团及环路参与了食管内脏高敏感性的应答和调节，亦不明了在内脏高敏感状态下哪些结构对食管化学刺激反应敏锐，且在人体开展CNS内形态学-功能的定位研究非常困难。因此，采用有效的动物模型来研究内脏敏感性改变的中枢敏化机制有着十分重要的意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　成年健康SD大鼠29只，雌雄不限，体质量225～285 g，由本校实验动物中心提供。将SD大鼠随机分为4组，A组：空白对照组6只;B组：食管酸灌注组8只;C组：OVA致敏组7只;D组：OVA及食管酸灌注组8只。

　　1.2 方法

　　1.2.1 食管酸灌注的方法 在实验的第14天，对C组、D组动物进行食管酸灌注。麻醉动物平卧位固定，头部抬高20°～30°，切开腹壁和胃壁，将一引流管放置在贲门处以收集从食管滴注的液体。把一单腔灌流管经口放置于食管内，导管开口位于食管和胃交界处上2～3 cm，固定导管，另一端与持续灌注泵相连。使用0.1 mol/L盐酸滴注，滴注液温度保持37 ℃，速度10 mL/h，共50 min。

　　1.2.2 脑组织切片的制备 食管酸灌注后30 min深度麻醉动物后立即开胸，经左心室至升主动脉插管并加压灌注200 mL生理盐水冲洗全身血液，随后用预冷的4 ℃含4%多聚甲醛的0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(PB，pH7.4)500 mL加压灌注固定1 h。然后取脊髓和全脑组织置于相同固定液中，在4 ℃条件下固定18～20 h，再移至含20%蔗糖的0.1 mol/L PB溶液中浸泡过夜至下沉(4 ℃)。用恒冷箱冰冻切片机-20 ℃ 行连续冠状切片，片厚40 μm，隔5取2，切片贴于经APES处理的载玻片上备用。

　　1.2.3 Fos表达的免疫组织化学染色 用含0.01 mol/L正常小牛血清、0.5% Triton X的PBS液室温下孵育2 h;滴加兔多克隆抗c-fos抗体稀释液(1∶2 000，Oncogen公司)，4 ℃孵育48 h;滴加二抗，SuperPicTure即用型二步法检测试剂盒(由上海蓝创生物公司提供)在37 ℃ 孵育10～15 min;DAB/H2O2法呈色;最后进行常规脱水、透明、中性树胶封片、光镜观察。

　　1.2.4 Fos阳性细胞计数方法 用日本Olympus BX-50光学显微镜观察，然后用江苏捷达科技提供的显微图像分析系统处理并计算出各脑区及神经核团内Fos蛋白阳性细胞数量的总和。

　　1.2.5 数据处理 应用SPSS11.0统计软件，采用方差分析比较各组间数值差异显著性，P<0.05有显著性差异。

　　2 结果

　　各组CNS内FLI神经元计数，从表1可看出：①B组大鼠的中央杏仁核、KF核群、下丘脑室旁核、下丘脑视上核、丘脑室旁核、臂旁核、疑核、三叉旁核、孤束核中央亚核和最后区等核团阳性细胞数量与对照组相比较有统计学意义(见表1，P<0.05)，而额顶叶皮质则仅有少数FLI颗粒。②C组在额叶皮质Ⅰ、Ⅱ区、扣带回皮质Ⅰ、Ⅱ区，及中央杏仁核、下丘脑室旁核、中脑导水管周围灰质、中尾段延髓的孤束核内侧亚核背侧和最后区内有中等密度的Fos阳性神经元表达，且与空白对照组相比有统计学意义。③D组大鼠额顶叶皮质(图1)、岛叶、扣带回、中央杏仁核、KF核群、疑核、臂旁核、下丘脑室旁核、丘脑室旁核、三叉旁核、孤束核、最后区、延髓网状核等核团(图2)FLI神经元的数目较单纯的食管酸灌注组和OVA致敏组显著增加(P<0.05)。

　　表1 四组大鼠不同脑区和核团Fos阳性神经元的数量比较(略)

　　*：与A组比较，P<0.05;#：与A组比较，P<0.05;△:B组和C组比较，P<

上一页  [1] [2] [3] [4] 下一页