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大鼠弥漫性脑损伤后MMP 9和GABA表达变化的研究 |
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电监护，呼吸机备用。大鼠清醒后笼中饲养，自由进食水。
1.3 标本采集及组织切片：分别于各时相点在深度麻醉状态下开胸，以40g/L多聚甲醛经心灌注固定1h，断头并取脑组织标本，置于100ml/L中性甲醛于4℃环境中后固定24h，石蜡包埋脑组织标本。大鼠脑组织标本冠状面连续切片，厚度5um，以经黏片剂处理过的载玻片捞片，置于60℃烤箱烘烤1h后备用。
1.4 免疫组化测定MMP_9和GABA表达：采用抗生物素-生物素-过氧化物酶复合法(ABC)。MMP_9和GABA亲和纯化兔抗体(一抗)购自Sigma公司，其工作效价1：100；免疫组化检测试剂盒购自美国Santa Curz公司。石蜡切片常规脱蜡至水，过氧化氢封闭，微波抗原修复20min，血清封闭，分别滴加兔抗鼠MMP_9和GABA一抗，室温孵育60min。0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗5min×3次，然后滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体，室温孵育20min，PBS洗5min×3次，DAB溶液显色，镜下控制反应时间，双蒸水终止反应，脱水、透明、封片，显微镜观察。免疫组化染色的切片行光镜检查，观察其染色强度，MMP_9和GABA阳性细胞表现为细胞浆呈棕色。评价方法：在200倍显微镜下随机选择10个高倍视野，计算阳性细胞数。
1.5 统计学处理：采用SPSS 11.0进行数据分析，每个变量表示为均数±标准差(x－±s)。统计学分析用ANOVA方差分析、相关分析。
2 结果
2.1 外伤后脑组织形态学变化：光镜下与假手术组相比，外伤后3h即可见脑组织血管内皮细胞轻度肿胀，血管壁通透性增加，多型核白细胞和单核巨噬细胞等炎性细胞附壁，部分浸润脑实质。6h这一现象明显，24h和72h可见大量的多形核白细胞和单核巨噬细胞积聚在水肿带。72h神经胶质细胞核细胞间隙水肿明显，神经元胞质呈严重缺血改变，假手术组却无此现象出现。
2.2 损伤脑组织的MMP_9的表达：免疫组化显示对照组脑组织的MMP_9表达很少，DBI后挫伤周围脑组织的MMP_9表达明显增强。MMP_9阳性细胞包括血管内皮细胞、神经胶质细胞和少数神经元细胞及侵入的中性粒细胞，这些细胞的胞浆呈棕黄色。与对照组相比，伤后3h可以观察到MMP_9的表达，24h达到高峰，至伤后7天仍保持较高水平(图1_A，B)。
2.3 损伤脑组织的GABA表达：GABA免疫反应阳性神经元细胞分布广泛，细胞胞浆均匀染色，DBI后大鼠伤侧皮层GABA阳性神经元逐渐减少，12h降至最低(图1-C，D)，72h恢复正常。
2.4 GABA活性与MMP_9的关系：结果显示DBI后挫伤周围脑组织MMP_9的表达逐渐增加，在伤后24h达高峰，至伤后7天仍维持在较高水平，而GABA的表达逐渐减少，在伤后12h达低谷，伤后7天逐渐恢复正常水平见表1。两者呈负相关(γ＝－0.615，P＜0.01)。表1 MMP_9和GABA阳性神经元的表达变化 注：与对照组比较P＜0.01，△P＜0.01
3 讨论
MMP_9是MMPs家族的成员，其分子中含有前蛋白胨、催化区和血红素结合蛋白序列，在生理状态下，其蛋白水解活性用来重塑组织结构，调控炎症进程。在病理状态下，MMP_9对脑组织的损害主要包括以下几个方面：破坏血脑屏障，扩大炎症反应；加速神经细胞脱髓鞘，阻断细胞间、细胞与ECM间的联系，导致细胞死亡。有多项研究显示，MMP_9是导致脑损伤后继发损伤的关键介质［5，6］。MMP_9酶原相对分子量为92kD，其活性形式相对分子量为83kD，主要底物有明胶，Ⅳ型、Ⅴ型胶原和弹性蛋白。MMP_9一经合成即以无活性形式从细胞内分泌到细胞外，在体内被特殊的蛋白酶切割而产生活性。MMP_上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] 下一页
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