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体外血小板流动腔研究方法的建立和应用 |
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nbsp; 2.3.1 血小板 正常生理浓度的血小板（300×108/L）悬液流经vWF包被的玻璃管时，视野中有大量的血小板黏着到玻璃管的表面。稳定黏附的血小板的数目与血小板悬液的浓度是正相关的。
2.3.2 CHO细胞 表达GPIbⅨ的CHO细胞（1.0×106/ml），流经vWF包被的玻璃管时黏附到玻璃管的表面。但由于经传代多次后，GPIb的表达量有所降低，因此黏附的细胞数明显减少，进一步表明细胞黏附的数目与细胞膜表面GPIb的表达量正相关。
3 讨 论
血小板发挥止血功能和产生血栓需要血小板黏着到内皮下基质，而这一过程是由血小板膜糖蛋白Ibα与vWF相互作用所起始的。GPⅠbα与vWF的结合诱导一系列的细胞内信号传导使得黏附的血小板被激活：Ca2+浓度的改变，蛋白激酶C、PI3K、蛋白磷酸化酶和酪氨酸激酶等的活化，并发生血小板肌动蛋白的重新排列[8]，活化整合素αIIbβ3介导更稳定的黏附，致密颗粒释放出内容物诱导血小板聚集。GPⅠbα与vWF的结合是血小板发挥其功能的关键步骤。
目前体外研究血小板功能的方法主要可分为2类：一类是在静止的条件下，例如流式细胞术，ELISA，免疫荧光染色，聚集仪。但是以上的这些方法都不能反应流动状态下血小板发生的黏附、聚集反应；另一类是采用平板流动腔和锥板黏度计研究剪切力对血小板的功能的作用[9]。平板流动腔结合显微镜、录像系统主要被应用于观察、检测流动状态下血小板的黏附反应，锥板黏度计主要应用于研究剪切诱导的血小板聚集（shearinduced platelet aggregation，SIPA）。这两种装置可以记录下流动条件下血小板黏附、聚集的全过程。
我们所建立的方法可观察和记录特定剪切率条件下，血小板或转染细胞发生黏附的过程。与通常使用的平行平板流动腔和锥板黏度计相比，我们的方法有以下几个优点：（1） 装配简单，剪切力不会因为装配的误差而产生影响。平行平板流动腔提供的剪切力与上下平板间距离的平方成反比，装配时的误差会对计算剪切力带来较大的影响。而锥板黏度计的锥尖由于长期使用会产生磨损，改变了锥体与平板间原有的角度，这样所产生的剪切力将不再是一致的。我们的方法不存在装配误差对剪切力的影响。（2） 样品使用量小，节约了样本。（3） 便于观察。由于玻璃管是透明的，我们在光学显微镜下就能清楚地观察到血小板悬液流动和黏附的情况。我们的系统也可以对血小板或细胞进行荧光染色观察。而目前还没有商品化的可视化的锥板黏度计，需要实验室自己加工。（4） 表面处理简单。当我们研究剪切力对血小板直接作用的机制时，必须消除血小板表面同实验系统间的相互作用。使用锥板黏度计时通常采用硅油或其它非血栓形成材料表面来消除这些相互作用。而使用玻璃管只需要采用BSA封闭就可以达到要求，操作简单又方便。
我们的方法也存在一些缺点。当负压系统提供动力时，是由于虹吸原理把细胞悬液吸入到玻璃管中，可在此过程中，水柱的液面高度差逐渐缩小，使得流速缓慢地发生改变。蠕动泵是在流动腔技术中广泛采用的，但是产生的是正弦流动，这与我们希望的稳定恒流不同。注射泵流速稳定，但不能建立循环的流动系统，由于血小板黏附反应时间较短，所以使用注射泵完全能够满足要求。本系统除了可以研究血小板和vWF的相互作用外，还可以用于研究血小板各种黏附因子与其受体的相互作用。本方法高效易行，能广泛应用于体外血小板的功能研究，在揭示止血和血栓的形成机制，以及诊断血栓疾病等方面有重要的应用前景。
【参考文献】
[1] STEWART OS.Calcium entry mechanisms in human platelets.Experimental Physiology[J].1997，82（5）：807823.
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