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体外血小板流动腔研究方法的建立和应用 |
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bsp;血小板 将血小板悬液流经包被有vWF的玻璃管，可见不断有血小板以滚动方式黏附到玻璃管表面，这是GPⅠbα与vWF的相互作用所介导的血小板在玻璃管表面的瞬时结合。其中大部分滚动的血小板经过一段时间后便不再滚动，牢固地结合在玻璃管表面，表明αⅡbβ3已被激活。也有一小部分血小板在短暂的停留即瞬时黏着后，又开始滚动，然后被冲走。见图2。
2.1.2 CHO细胞 由于血小板是无核细胞碎片，无法对其进行基因调控以及蛋白表达变化情况进行研究。为克服这一缺陷，我们将GPⅠbα、GPIb和GPⅨ 基因导入CHO细胞，建立了能表达完整的GP IbⅨ的CHO细胞。为研究表达GP IbⅨ的CHO细胞在该系统中的作用与血小板有无差别，我们将CHO细胞悬液流经玻璃管，也同样观察
到和血小板一样的黏附现象。说明该系统也同样适合于对表达GP IbⅨ复合物的细胞与vWF的相互作用情况进行研究。见图3。A．剪切率1034.166s1，血小板浓度1.32×107/ml。由于浓度降低，血小板黏附的数目明显减少。
B．剪切率1034.166s1，细胞浓度1.6×105/ml。由于细胞没有吹散，有连在一起的2个细胞一起发生黏附。黏附的细胞数比低剪切率情况下多，说明高剪切力有利用GPIb与vWF的结合。
2.2 蠕动泵 蠕动泵产生流量近似为正弦式的脉动流，更类似于血液流动的情况，而且，蠕动泵的动力系统可机械调控，能提供一个相对较高的剪切力环境，因此，我们选择蠕动泵对作为动力来源，对血小板在该流态下与玻璃管表面vWF的结合情况进行了研究。本研究中使用的流体剪切率为1034.166s1，相当于41.4 dynes/cm2，略高于正常人动脉中的剪切力范围20～30 dynes/cm2。有研究显示[7]，随着剪切力从低变高，GP IbⅨ介导的血小板黏附增多。为进一步验证这一结论，我们分别对在本条件下，对血小板和CHO细胞与vWF相互作用情况进行研究，并与2.1中的结果进行比较。
2.2.1 血小板 我们把血小板的浓度稀释1倍，血小板流经玻璃管壁与vWF相互接触的几率就变小，因此发生稳定黏附的血小板数目必然减少。血小板悬液经蠕动泵产生的剪切率为1034.166s1的流态通过vWF包被的玻璃管后，仍然有一定数量血小板发生了稳定黏附。见图4
图4 在注射泵提供的流态下血小板和表达GPIbⅨ的CHO细胞在vWF表面的黏附情况
A．剪切率250s1，血小板浓度3×108/ml。正常生理浓度情况下，大量的血小板与vWF结合。
B．剪切率250s1，细胞浓度1.0×106/ml。传代多次后，GPIb的表达量降低，黏附的细胞数减少。细胞黏附的数目与细胞膜表面GPIb的表达量正相关。
2.2.2 CHO细胞 我们把与2.1中相同浓度表达GP IbⅨ复合物的CHO细胞，在蠕动泵较高的剪切力作用下通过vWF包被的玻璃管，可见，与低剪切力（负压装置）条件相比，有更多的细胞稳定黏附到玻璃管壁上。
结果表明，在蠕动泵产生的脉动流态下，可以观察到血小板膜蛋白GP IbⅨ和vWF的相互作用；在相对较高剪切力条件下，GPIbⅨ介导的血小板在vWF表面的黏附增多。
2.3 注射泵 注射泵可以提供一个比较宽的剪切率范围（217 000 s1），虽然其流态仍然是脉动流，但相对于蠕动泵要平稳的多，因此，我们用注射泵作为动力来源，对血小板在该流态下与玻璃管表面vWF的结合情况进行了研究。选择剪切率为250s1。
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