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体外血小板流动腔研究方法的建立和应用 |
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mm，外径1.2 mm，长7.5 cm，Harvard Apparatus Inc.）。
1.2 实验方法
1.2.1 vWF的包被 用0.1M的NaHCO3（pH 8.3）把vWF稀释到30 μg/ml，注入玻璃管，置于湿盒中4℃孵育过夜。PBS冲洗玻璃管3次。PBS液配制5%的牛血清白蛋白室温下封闭2 h。PBS冲洗玻璃管3次。
1.2.2 血小板悬液制备 取健康献血者新鲜的静脉血，加入1/7的ACD（2.5%柠檬酸三钠，2.0%D葡萄糖，1.5%柠檬酸）抗凝。300 r/min离心10 min取上清得到血小板富集血清（PRP）。PRP，1 500 r/min，离心15 min。CGS（0.12 M NaCl，0.0129M柠檬酸三钠，0.03M D葡萄糖，0.1%牛血清白蛋，pH 6.5）洗2次，Modified Tyrode’s Buffer（2.5 mM Hepese，150 mM NaCl，2.5 mM KCl，12 mM NaHCO3，5.5 mM D葡萄糖，1 mM CaCl2，1 mM MgCl2，1mg/ml BSA，pH 7.4）重悬浮血小板。37℃下静置1～2 h使血小板重新恢复到静息状态。
1.2.3 转染GPIbⅨ的CHO 表达GPIbⅨ的CHO细胞生长至100%盖满培养瓶，取出75%重植在新培养瓶生长过夜。消化下CHO细胞，Modified Tyrod’s Buffer重悬浮细胞。室温下静置1/2 h。
1.3 流动腔实验 把包被了vWF的玻璃管装在倒置显微镜上，分别使用负压装置、蠕动泵、恒定注射泵3种动力系统，根据公式r=4qπr3精确计算玻璃管中的剪切率[4]，使得血小板或CHO细胞悬液通过玻璃管。流动起始后，显微录像系统显示并记录玻璃管中的情况。最后用Modified Tyrode’s Buffer在同样剪切率调节下冲洗玻璃管5 min，仍然黏附的细胞即为激活了整合素αⅡbβ3的稳定黏附。
2 结 果
血小板血栓的形成与血管中的血流情况密切相关[5]。病理性剪切力能诱导血小板的黏附、聚集[6]。有研究者采用平板流动腔和锥板黏度计来模拟体内血液流动。我们采用细玻璃管简单而直观的观察到流动条件下血小板与vWF结合的全过程（示意图见图1）。GPⅠbα与vWF的相互作用使得血小板在vWF表面以滚动的方式发生瞬时的黏附，同时启动血小板内一系列细胞信号转导途径，最终激活整合素αⅡbβ3导致血小板发生稳定的黏附。
图1 实验系统示意图
把包被了vWF的玻璃管装在倒置显微镜上，通过硅胶管连接到提供动力装置，样品分别在负压装置、蠕动泵、恒定注射泵的带动下流经玻璃管，在流出口收集样品。同时通过CCD系统将图像传输到计算机，同步显示并录像。
2.1 负压系统 利用虹吸原理，根据液面差的不同，可提供相对较恒定流态的流体环境。但限于装置本身的特点，往往只能提供较低剪切率的流体环境，本研究中使用的流体剪切率为315.817s1。
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