大蒜素对胃上皮细胞Cx37 Cx43 mRNA表达及细胞间隙连接通讯功能的影响

    ［Key words］  allicin；gastric epithelial cell；gap junction intercellular communication

    细胞间隙连接通讯（GJIC）功能在控制细胞生长和保持细胞数量稳态方面具有重要的作用［1］。肿瘤细胞GJIC功能的缺失总是伴随着特定的组织特异性间隙连接蛋白基因（Cx基因）表达的下调。Cx是GJIC的结构基础，连接蛋白和GJIC 功能的异常与肿瘤发生、发展密切相关。大量研究资料表明，Cx基因在多种肿瘤细胞表达下降或消失［2］，许多促癌剂和某些活化的癌基因可使Cx基因表达降低，下调GJIC，间接证明了Cx基因及GJIC的下调与肿瘤进展有关［3］。因此通过增加连接蛋白表达，改善和恢复细胞GJIC抑制，将对肿瘤有重要作用。大蒜素（allicin） 又名大蒜新素，可促进BGC-823胃癌细胞间通讯的恢复。本研究观察大蒜素对胃上皮细胞MGC-803 Cx 37、Cx 43 mRNA表达及细胞间隙连接通讯功能的影响，进一步探讨大蒜素抗肿瘤的作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料  人胃低分化黏液腺癌细胞系MGC-803细胞，由中南大学湘雅医学院肿瘤研究所提供。大蒜素注射液浓度为15 mg/ml，主要成分为二烯丙基三硫化合物，纯度大于99.5 %，购自上海禾丰制药厂。逆转录试剂盒购自Fermentas公司。RT-PCR引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。罗氏黄（Lucifer yellow）购自美国Sigma公司。

    1.2  方法  （1）细胞培养和大蒜素干预:对数生长期的MGC-803细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，接种在24孔板和50 ml培养瓶内，细胞贴壁后弃去原有培养基，加入大蒜素和新鲜培养基使其终浓度分别为3、6、9、12 μg/ml，同时设立不加大蒜素的对照组，每组设3个重复孔。分别培养24、48、72 h。 （2）划痕标记染料示踪观察细胞的GJIC功能：接种细胞在24孔板内，PBS洗4次，弃净液体，细胞浸泡在含0.05% Lucifer Yellow （Sigma）的PBS液内，每孔500μl，用锐利刀刃轻轻划痕，放置3min，弃净液体，并以PBS洗4次，立即用倒置荧光显微镜观察摄像，KP490滤光片观察荧光染料传输情况。（3）RT-PCR法检测Cx 43 mRNA。Cx 37 mRNA 的表达：采用Trizol试剂提取细胞总RNA，合成基因引物Cx 43（277bp）:5’-CTCGCCTATGTCTCCTCCTG-3’，5’-ACGACTGCTGGCTCTGCTTG-3’。Cx37（177bp）：5’-AGTGTGGGGTGACGAGCA A-3’，5’-CGCCGAGACAGGTAAATGA-3’。GAPDH（452bp）:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3’。取RNA样品2μg按试剂盒操作程序进行逆转录，Cx 43、Cx 37PCR扩增：95 ℃ 2 min 30 s；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；最后72℃延伸5 min；4 ℃保存。GAPDH：95 ℃ 2 min 30 s；94 ℃ 40 s，59 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共30个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。分别取5 μl扩增产物，经1％琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物。

    1.3  统计学方法  实验数据均采用均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS 12.0软件进行方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

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