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肿瘤坏死因子 G252A C804A基因多态性与脑梗死的关系 |
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;研究对象 CI组88例，为深圳市宝安人民医院2005年11月~2006年12月的住院患者，均符合1996年全国脑血管病学术会议修订的诊断标准，并经CT或MRI证实。排除标准：（1）短暂性脑缺血发作者，（2）合并颅内出血者，（3）风心病或房颤并脑栓塞者；其中男47例，女41例，年龄51~79岁，平均年龄60.4±8.9岁。对照组81例，男 47 例，女34例，年龄39~76岁，平均年龄58.9±5.1岁，系本院体检中心健康体检者，按照WHO MONICA方案的危险因素标准，除外心、脑血管疾病。
1.2 方法
1.2.1 试剂 DNA分离纯化试剂盒（puregene DNA isolarion kits）为Gentra公司产品；Taq DNA聚合酶、dNTPmix、NcoI 限制性内切酶为MBI Fermentas公司产品；DNA Ladder为BBI公司产品。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR 清洁试剂盒为Vgene公司产品。
1.2.2 DNA抽提 清晨空腹抽取外周静脉血2 ml, 以枸橼酸抗凝，用DNA分离试剂盒从全血中分离白细胞的基因组DNA，操作按试剂盒说明进行。
1.2.3 PCR引物设计及合成 参照有关文献[6,7]设计引物, P1: 5′AGAGCTGGTG GGGACATGTCTG3′； P2: 5′CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA3′； P3: 5′GAGGTGAGCAGCAGGTTTGAGGG3′； P4: 5′GAGGTGAGCAGC AGGTTTGAGGT3′。P1、P2扩增第1内含子至第3外显子的一段基因, 长度为740 bp；P3、P4是针对TNFβ 804等位基因的两条序列特异性引物，分别与P2配对，构成两套内引物，扩增特异性694bp的条带。
（1）G252A基因型采用PCRRFLP方法鉴定, 扩增体系为50 μl，含引物P1、P2各40 pmol, dNTP 0.05mmol/L，Taq DNA聚合酶2 u，模板DNA 8 μl，10×PCR缓冲液(含25 Mm MgCl2)。扩增条件：95℃预变性6 min，按以下条件循环30次:95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s。末次循环后，72℃再延伸7 min。取10 μl纯化后的PCR扩增产物，加5 u NcoⅠ限制性内切酶于37℃孵育16 h，酶切产物经含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳以确定基因型。
（2）C804A基因型采用PCRSSP技术鉴定，扩增体系为50 μl，含序列特异性引物P2、P3(或P4)各20 pmol, dNTP 0.05 mmol，Taq DNA聚合酶 2 u，上述P1、P2引物扩增的产物（740 bp）2μl作模板，10×PCR缓冲液(含25Mm MgCl2)。扩增条件：95℃预变性6 min，加入Taq酶，按以下条件循环7次:95℃变性45 s，65℃退火5 s，72℃延伸30 s。末次循环后，72℃再延伸7 min。扩增产物经纯化后用含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳以确定基因型。
1.3 统计学分析 应用SAS8.0软件包进行统计分析。计量资料组间比较用t检验。计数资料上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] 下一页
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