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简述线粒体电压依赖阴离子通道对携带线粒体DNA A4263G突变的细胞株线粒体钙循环的影响 |
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l DNA, mtDNA)突变的高血压患者细胞线粒体钙循环中的作用，我们在对具有母系遗传特点的原发性高血压流行病学调查研究的基础上，对前期发现的携带mtDNA 4263A→G突变的原发性高血压大家系患者采集血液样本，通过建立传代的淋巴细胞系[5]，分别加入VDAC抑制剂——环孢素A(CsA)[6]和ANT开放剂——苍术苷(atractyloside)，利用共聚焦显微镜技术研究VDAC在携带mtDNA突变的高血压患者细胞线粒体钙循环中的作用，在前面研究的基础上进一步探讨mtDNA突变导致血压升高可能的分子机制。
1 材料与方法
1.1 传代淋巴细胞的建立 通过EpsteinBarr病毒(中国科学院遗传所馈赠)转染的方法建立传代淋巴细胞系[5]，淋巴细胞系分别来自携带mtDNA tRNAIle 4263 A→G点突变的母系遗传性母系原发性高血压家系中的4位成员( Ⅱ4、Ⅲ14、Ⅲ18为诊断原发性高血压者;Ⅲ19为血压正常者)和遗传背景相同的3位正常对照者(A1、A2和A3)。以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(美国Gibco公司)培养淋巴细胞。
1.2 共聚焦显微镜检测线粒体内钙([Ca2+]m)和线粒体膜电势(Δψm) 通过Rhod2荧光染料标记[Ca2+]m;通过荧光染料JC1标记线粒体膜，检测Δψm。将对数生长的淋巴细胞悬液，用PBS离心洗涤(1000 r/min，5 min)2次，将悬浮的淋巴细胞与Rhod2AM(10 μmol/L)在4 ℃条件下孵育120 min，然后置于37 ℃条件下孵育30 min(预冷/温育两步法使荧光染料Rhod2特异性的进入到线粒体内[7])。将悬浮的淋巴细胞与JC1染料(0.5 μmol/L)在37 ℃条件下孵育10 min。然后分别将淋巴细胞在37 ℃条件下用正常台式液悬浮。Rhod2激发波长540 nm，通过滤光片在605 nm检测。JC1激发波长488 nm，红色荧光在580 nm滤波下检测。
1.3 统计学方法 计量资料采用均数±标准差表示，2组间均数的比较采用独立t检验，以P<0.05为有统计学差异。所有资料均采用SPSS 11.0进行统计学分析。
2 结果
2.1 共聚焦显微镜检测[Ca2+]m 根据文献报道发现大鼠心肌细胞加入钙离子拮抗剂等药物后对[Ca2+]m及Δψm有影响，而对于非可兴奋细胞还没有研究报道。我们的研究发现正常人外周血淋巴细胞在高钙环境下，加入苍术苷后[Ca2+]m浓度增加(P<0.05)，在加入CsA后[Ca2+]m浓度略降低，说明苍术苷可以促进胞浆内钙进入，而CsA可以抑制这种改变;而携带mtDNA突变的患者细胞系在加入苍术苷后[Ca2+]m浓度没有明显改变，加入CsA后[Ca2+]m浓度反而增加(图 1，见封二)。
2.2 共聚焦显微镜检测Δψm 本实验用JC1荧光染料标记Δψm，检测发现JC1指示正常对照者细胞株加入苍术苷后Δψm降低(P<0.05)，加入CsA后没有明显变化。携带mtDNA A4263G突变者细胞株加入苍术苷后Δψm降低，加入CsA后同样没有明显变化(图1，见封二)。
2.3 加入苍术苷和CsA后[Ca2+]m和Δψm随时间变化情况 正常对照者细胞系加入苍术苷后[Ca2+]m浓度逐渐增加，加入CsA后[Ca2+]m先降低而后增加;加入苍术苷后Δψm变化不明显，加入CsA后降低。而突变携带者加入苍术苷后[Ca2+]m浓度没有明显变化，加入CsA后前20 min没有明显变化，20～30 min明显增加;加入苍术苷后Δψm降低，加入CsA后变化不明显，突变携带者细胞株变化与正常对照者一致(图2，见封二)。
3 讨论
无论何种细胞，每当细胞参与钙信号激活时，都有钙信号传导进入线粒体内，包括三羧酸循环(TCA)、ATP合成等。在可兴奋细胞线粒体与ER、SR和细胞膜之间的Ca2+传导之间有着密切的联系。研究表明线粒体钙超载参与了多种疾病发病，线粒体钙循环上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] 下一页
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