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一种总体止血能力的检测方法及其应用 |
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长到340 nm，设置测试时间30 min，以缓冲液调节测试零点。预先在比色皿中加入待检血浆100 μl和适量UK（用以激活血浆纤溶酶原），随后加入900 ul含组织因子的缓冲液（0.1mmol/L Tris、20g/L PEG6000、10g/L Tween80、5 mmol/L CaCl2，pH 7.35），立即混匀，然后置于测试孔内，按动测试键。仪器自动监测和记录纤维蛋白形成和降解过程的吸光度变化，计算反应曲线内面积（根据总吸光度计算），求出OHP。
1.4.2 总体凝血能力（OCP）测定 采用与上述OHP测试相同的反应体系、实验条件和操作方法，但反应体系不含纤溶酶原活化剂UK，监测30 min内纤维蛋白形成过程的吸光度的变化，计算反应曲线以内总吸光度，求得OCP。
1.4.3 总体纤溶能力（OFP）判断 按下列公式计算：OFP=（OCP-OHP）/OCP×% 。
1.4.4 因子Ⅷ测定 采用标准一期法测定。
1.5 统计学方法 成组t检验及相关分析采用SPSS 12.0软件。
2 结 果
2.1 不同浓度组织因子对OHP的影响 OHP测试要求全面激活凝血反应，但通常的凝血激活物并不符 合这一要求。例如，以常规浓度的组织因子（TF）激活血浆时，凝血沿外源凝血途径运行（凝血酶原时间），而绕过内源凝血途径，若以部分凝血活酶激活血浆时，凝血则沿内源凝血途径运行。很早我们就注意到［3］，低浓度的TF可以同时激活内源凝血途径。如图1所示，在相对高浓度的TF存在下，正常对照血浆与因子Ⅷ缺乏血浆的OHP值（曲线以内面积）并无明显差别。但是，当TF浓度降至1/20 000稀释度以下时，与对照血浆比较，因子Ⅷ缺乏血浆的OHP值明显降低。而用正常血浆重建因子Ⅷ缺乏血浆后，OHP值得到恢复（结果未显示）。说明这是由于因子Ⅷ缺乏而导致因子Ⅷ反馈活化环节受阻，所生成的少量凝血酶不能够通过该机制放大凝血酶的生成，从而减缓纤维蛋白原转变率，导致OHP值降低。这一结果清楚地表明，在我们的实验条件下，以低浓度TF激活血浆时，凝血反应开始依赖内源凝血途径。换言之，低浓度TF可以同时激活内、外源凝血途径。因此，选择1/20 000稀释度的TF作为凝血激活物。
2.2 不同浓度UK对OHP的影响 在试验体系中加纤溶酶原激活物，激活纤溶系统，用以测定纤溶能力。我们采用UK作为纤溶酶原激活物。选择UK浓度的标准是，能使形成的纤维蛋白在规定的30 min内完全降解，同时对纤维蛋白原不产生明显影响。从图2可以清楚地看到，当UK浓度小于30 u/ml时，所生成的纤维蛋白不能被有效降解；UK浓度大于50 u/ml时，虽然纤维蛋白能够被迅速降解，但纤维蛋白的形成却明显降低。说明较高浓度的UK对纤维蛋白原有降解作用，不宜用作测试。因此，选择UK浓度40 u/ml作为纤溶激活物。
2.3 不同浓度聚乙烯二醇对OHP的影响 凝血反应过快或过慢，都会影响测试的敏感性。根据测算，适宜的凝血反应延滞时间应当在3～5 min范围内。因此，在OHP测试体系中加入一定量聚乙烯二醇6000（PEG6000），用以调节凝血反应的延滞时间（lag time）和提高测试的敏感性。加Tween80则用于消除PEG60000引起的非特异性沉淀，起稳定相作用。根据对不同浓度PEG60000的筛选结果，保持反应延滞时间在3～5 min的PEG6000浓度为上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] 下一页
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