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特发性血小板减少性紫癜患者激素敏感性与糖皮质激素受体亚型的关系研究 |
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bsp;μl，上、下游引物各0.15 μl，含荧光探针的反应混合液SYBR Green master mix （购自Applied Biosystems，ABI）5.0 μl，无菌蒸馏水4.2 μl，总反应体积为10 μl。反应条件：PCR扩增前先于50℃孵育2 min，后再于95℃孵育10 min，随后进行PCR循环，包括95℃ 15s，60℃ 60 s，共40个循环。所有PCR反应均使用ABI PRISM 7900实时定量PCR仪（购自Applied Biosystems，ABI），按照其说明书进行操作，数据由该仪器收集并分析。待测目的基因mRNA表达量计算方法：应用Applied Biosystems公司提供的分析软件，以管家基因β－actin作为内参照，待测目的基因相对表达量以2⊿Ct表示，其中⊿Ct是内参照基因和目的基因Ct值的差值。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
1.4 免疫组织细胞化学方法检测 PBMC内GRα和GRβ的蛋白表达 取4×104个PBMC，经磷酸缓冲液清洗，细胞涂片仪离心涂片，过夜自然晾干，采用兔抗人GRα和GRβ 抗体（购自Santa Cruz, CA,USA），按照试剂说明书进行操作，兔抗人GRα和GRβ抗体浓度分别为1∶300、1∶200。最后在光学显微镜下计数每100 个PBMC细胞中的免疫反应阳性细胞数，计算百分比。
1.5 统计学处理 测定结果采用x±s表示，比较采用t检验，P<0.05表示有统计学意义。
2 结 果
2.1 激素敏感型和激素抵抗型ITP患者以及健康志愿者PBMC内GRα和GRβ mRNA表达水平 激素抵抗型ITP患者PBMC内GRβ mRNA表达量明显高于激素敏感型ITP患者及健康志愿者 (P<0.01)，而PBMC内GRα mRNA表达水平，各组之间的差异无统计学意义 (P>0.05)。检测结果见表1。表1 不同组别PBMC内GRα和GRβ mRNA表达的比较组别 例数 GRα mRNA GRβ mRNA激素敏感型ITP 23 10.21±2.12 3.11±0.69激素抵抗型ITP 17 11.12±3.81 8.21±0.61*正常对照组 20 10.13±2.53 2.11±0.33*激素抵抗型ITP与激素敏感型ITP、正常对照组比较P<0.01
2.2 激素敏感型和激素抵抗型ITP患者以及健康志愿者GRα和GRβ蛋白免疫组化阳性的PBMC比率 激素抵抗型ITP患者GRβ蛋白免疫组化阳性PBMC比率明显增高，与激素敏感型ITP患者及健康志愿者比较，差异有统计学意义(P<0.01)，而GRα蛋白免疫组化阳性PBMC比率，各组之间无显著差异((P>0.05)。检测结果见表2。表2：不同组别GRα和GRβ蛋白免疫组化阳性的PBMC比率
3 讨 论
ITP患者对糖皮质激素耐药的机制较为复杂，由于糖皮质激素的药理效应主要通过靶细胞内GR介导程序化地打开或关闭一系列基因的表达来实现，因此，GR成为研究糖皮质激素抵抗机制的重要切入点。人类GR包括两大亚型GRα和GRβ，虽然两者蛋白结构上只是羧基端不同，但GRα能够与激素结合并激活相应基因转录，而GRβ无激素结合活性以及激活靶基因转录能力，因而，有学者认为，GRβ可能是一种重要的内源性糖皮质激素效应负性调节因子，它的表达量某种程度上决定了靶细胞对糖皮质激素的敏感性[5]。鉴于此，近来有关免疫性疾病糖皮质激素抵上一页 [1] [2] [3] [4] 下一页
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