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大鼠凝血因子 EGF 1片段结合功能的体外研究 |
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sp;h，用0. 25%胰酶∶0.2%EDTA=1∶1消化，PBS充分洗涤3次后上流式细胞仪检测。
1.2.4 荧光显微镜观察FⅦ EGF 1多肽结合活性 将生长良好的RAOEC以2×105 /孔分别接种于预先置有盖玻片的24孔板中爬片，常规培养24 h贴壁后， LPS诱导组细胞中分别加入0.1 μg/ml LPS作用4 h，PBS洗涤后与阴性对照组分别加入8 μmol/L大鼠凝血因子ⅦEGF 1多肽，37℃孵育2 h，PBS充分洗涤后在倒置荧光显微镜下观察。
1.3 统计学分析 以上试验重复3次，应用SPSS 12.0 统计软件包进行统计分析,采用χ2检验。
2 结 果
2.1 LPS刺激RAOEC后TF抗原表达的结果 LPS诱导组与阴性对照组（16.22%±1.34%）比较,TF表达水平明显增高（见图1，图2）,以作用后4 h最为明显(42.67%±3.02%),二者差异具有显著性(P<0.01) 。LPS作用于RAOEC 2 h后TF即有表达增加（29.79%）,至4 h达高峰（43%）,6 h TF表达量开始下降（32.89%）,至18 h下降到接近未刺激前水平（18.34%）。
2.2 流式细胞仪检测FⅦ EGF 1多肽结合活性 与阴性对照组相比，大鼠凝血因子Ⅶ EGF 1多肽能结合LPS刺激后RAOEC，差异具有显著性意义（P<0.01)，随着多肽浓度的增加，荧光细胞增多，但16 μmol/L EGF 1多肽作用LPS刺激后的RAOEC，荧光细胞百分率降低。见表1。表1 流式细胞仪检测大鼠凝血因子Ⅶ EGF 1片段结合功能 荧光细胞（％）空白对照组 0.95±0.34阴性对照组＋4μmol/L EGF 1多肽 18.56±1.25LPS诱导组＋4μmol/L EGF 1多肽 42.26±2.56*LPS诱导组＋8μmol/L EGF 1多肽 86.78±2.49LPS诱导组＋16μmol/L EGF 1多肽 49.54±3.73 与阴性对照组相比,*P<0.01
2.3 荧光显微镜观察FⅦ EGF 1多肽结合活性 与阴性对照组相比，大鼠凝血因子Ⅶ EGF 1多肽能明显结合LPS刺激后RAOEC（见图3，图4）。
3 讨 论
在体内正常的内皮细胞不表达TF ,培养的内皮细胞不表达或低表达TF【2】，培养的细胞在一系列因素刺激下可以高表达TF，包括细菌脂多糖LPS【3】，某些炎症细胞因子如白介素1、肿瘤坏死因子、氧化的低密度脂蛋白、凝血酶和佛波醇等，这些说明TF在各种病理进程中起着重要的作用【4】。本试验用0.1μg/ml LPS作用RAOEC 2、4、6、18 h，观察细胞TF 的表达, 结果发现LPS作用于RAOEC 2 h后TF 即有表达,至4 h达高峰。 6 h有所下降，18 h下降到接近未刺激水平。大量研究证明，人凝血因子FⅦGla区、EGF1区和重链的第195～206的残基以及其它某些部位可能参与FⅦa与TF之间的相互作用[5]。最早研究的是FⅦa的Gla区，研究者利用组织蛋白酶G的酶解作用和缺Ca2+条件下FⅦa的自分解作用分别产生脱去残基1～38和1～44的FⅦa，FⅦa与TF的亲和性明显降低，说明FⅦa的Gla区对FⅦa与TF结合具有重要影响。但纯化的FⅦa 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] 下一页
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