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大鼠凝血因子 EGF 1片段结合功能的体外研究 |
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【摘要】 目的 探讨大鼠凝血因子Ⅶ EGF 1片段与脂多糖( LPS)刺激后的大鼠血管内皮细胞(RAOEC) 结合能力。方法 将0.1 mg/L LPS作用RAOEC 2 h、4 h、6 h、18 h,应用免疫荧光法检测TF蛋白在RAOEC的表达,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L的大鼠凝血因子ⅦE GF 1多肽与LPS作用后的RAOEC的结合能力。结果 0.1 mg/L LPS能刺激RAOEC表达组织因子（TF）,4 h最为明显，4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L大鼠凝血因子Ⅶ EGF 1能结合 LPS刺激后的RAOEC。结论 大鼠凝血因子ⅦEGF1片段能结合 LPS刺激后RAOEC 。
【关键词】 凝血因子Ⅶ； RAOEC； LPS
合物能增加FⅦa对其底物Ⅸ和Ⅹ的蛋白水解活性，所以能激活内、外源性凝血途径，TF/FⅦa复合物被认为是引发凝血瀑布的关键蛋白［1］。血栓形成的机制极为复杂,涉及血管壁、血小板、凝血及纤维溶解系统,而凝血活性异常是动脉血栓形成的主要原因之一。本实验研究大鼠凝血因子Ⅶ EGF1片段与LPS刺激后表达TF的内皮细胞结合,为进一步研究TF的调控及血栓形成的防治打下基础。1 材料与方法
1.1 材料 RAOEC及培养液购自美国Cellapplication 公司。FITC标记的大鼠凝血因子Ⅶ EGF1多肽由西安华辰生物科技有限公司合成。LPS购自Sigma公司。 TF多克隆抗体和FITC二抗试剂盒购自武汉博士德公司。免疫组化SP试剂盒均为即用型，购自北京中山生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养与分组 细胞置于37 ℃,5 % CO2 孵箱培养,每2 天换液1 次,细胞呈铺路石状,3~4 d细胞生长汇合后,用0. 25 %胰酶∶0.2%EDTA=1∶1混合消化传代。用4~6代细胞进行实验。将培养的RAOEC分为2组：① 阴性对照组：不加LPS刺激。② LPS诱导组:0.1 μg/ml LPS刺激RAOEC 2 h、4 h、6 h、18 h。
1.2.2 TF抗原的检测 将生长良好的RAOEC以2×105 /孔分别接种于预先置有盖玻片的24孔板中爬片，常规培养24 h贴壁后，加入0.1 μg/ml LPS，于37 ℃,5 % CO2 条件下作用0、2、4、6、18 h，终止培养做免疫组化分析。采用免疫组化SP法, DAB显色,以PBS代替一抗作为阴性对照, 以已知的阳性（表达TF抗原的）小鼠黑色素瘤细胞B16F10作为阳性对照,免疫组化步骤按SP试剂盒说明书进行。免疫组化结果判断: TF阳性定位于细胞浆或细胞膜。计数200个细胞，计算阳性细胞率。
1.2.3 流式细胞仪检测FⅦ EGF 1多肽结合活性 将生长良好的RAOEC以1×106/孔分别接种6孔板，24 h待细胞贴壁后诱导组每孔加入0.1μg/ml LPS作用4 h，对照组不加LPS处理，PBS洗涤后两组加入4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L大鼠凝血因子ⅦEGF 1多肽，空白对照组不做任何处理，37 ℃,5 % CO2 条件下孵育2&nb[1] [2] [3] [4] [5] 下一页
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