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出血性血小板病患者凝血酶受体GP Ib IX V复合物表达研究 |
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0％者为反应缺如。本组纳入病例均对一项或多项诱聚剂诱导的聚集反应不良或缺如。根据出血部位，经内科、耳鼻喉科、妇科、口腔科和眼科等科室诊视，未发现特异诊断性病灶，患者血压、心率正常。且均经瑞斯托霉素(ristocetin)检测，排除血小板无力症。
1.2 对象及分组 101例出血性血小板病患者均为2004年8月～2008年3月间我院中西医结合科门诊及住院就诊或复查的病人。患者及其家属对本实验知情同意。根据出血性血小板病出血控制情况，分为出血性血小板病出血组68例，男25例，女43例，年龄13～61岁，平均33.58±15.34岁，病程1～12年。68例共计121个出血部位，其中肢体皮肤瘀班或瘀点53例，鼻出血21例，月经过多(每次月经量估计在150 ml以上者)20例，齿龈出血17例，眼底出血6例，球结膜出血4例。出血性血小板病出血控制组33例，经治疗出血症状控制，且随访半年以上未复发者，男14例，女19例，年龄33.28±10.42岁。另选本院体检中心健康体检者32例作为正常对照组，男15例，女17例，年龄34.21±7.14岁，所有受检者外周血小板计数均大于50×109/ L，在检查前两周内，均未服用阿司匹林、潘生丁、肝素以及活血化瘀类中药等影响血小板功能的药物。
1.3 主要材料与仪器 藻红素（phycoerythrin, PE）标记的GP Ibα单克隆抗体CD 42b为美国BioLegend公司产品。GP Ib/IX/V复合物单克隆抗体CD 42abcd为美国ALEXIS公司产品。异硫氰酸荧光(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记二抗为美国KPL公司产品。血小板诱聚剂二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）、花生四烯酸(arachidonic acid，AA),血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)均为美国Sigma公司产品。FACS 420型流式细胞仪（美国BectonDickison公司），Chronolog 430型血小板聚集仪（美国Chronolog公司），台式低速离心机（德国eppendorf公司）。
1.4 血小板聚集率测定 将3.8％枸橼酸钠抗凝后全血在台式低速离心机上以900 r/min离心10 min，取上清即为富血小板血浆（platelet rich plasma, PRP）。将剩下部分以3 800 r/min再次离心5 min，取上清即为乏血小板血浆（platelet poor plasma, PPP）。用PPP平衡血小板聚集仪，然后以ADP（终浓度1.90μmol/L）、AA（终浓度0.37 μmol/L)、PAF（终浓度150 nmol/L)作为血小板诱聚剂，加入PRP中,在血小板聚集仪上检测血小板最大聚集率（maximum agglutination， MAR）。
1.5 GP Ib/IX/V及Ibα检测[4] 采用真空采血管（美国BD公司），经肘正中静脉采集清晨空腹静脉血3 ml，以3.8％枸橼酸钠抗凝，血液与抗凝剂的比例为9∶1。将抗凝后全血，以1％多聚甲醛固定45 min。取50 μl加至流式检测管，后分别向不同管中加入20 μl GP Ib/IX/V 复合物单克隆抗体CD 42abcd和PE标记的GP Ibα单克隆抗体CD 42b，混匀室温避光孵育30 min，然后CD 42abcd标记的样本中加入20 μl FITC标记的羊抗鼠IgG,混匀室温避光孵育30 min。用0.2 M PBS定容至500 μl，于FACS 420型流式细胞仪上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] 下一页
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