重症肌无力患者骨骼肌肌肉蛋白成分分析

　　资料和方法

　　1． 样品来源：正常人肌肉标本10份，取于10例骨折手术病人的肢体骨骼肌。MG患者肌肉标本17份，取于17例全身型MG患者，无呼吸肌受累，其中8例伴胸腺瘤，9例伴胸腺增生。肌肉取自MG患者胸腺切除手术切口周围的骨骼肌，标本均于-27℃保存。

　　2． 蛋白的提取及浓度的测定：蛋白按常量及微量两种方法进行提取。常量提取：肌肉样品取米粒大小置微量玻璃匀浆器，加入100 μl肌球蛋白提取液Gubstraub溶液(0.3 mol/L KCl，0.10 mol/L KH2PO4，0.05 mol/L K2HPO4,pH 6.5)，冰浴下制成匀浆，吸出肌肉匀浆，加50 μl提取液洗涤，合并匀浆液并放置4℃过夜，10 000×g离心15 min，上清液再经25 000×g离心10 min，按Spector［5］方法测定蛋白浓度。微量提取：将低温贮存的肌肉标本移至4℃冰箱，放置片刻使其软化，取一小块肌肉置解剖镜下滴加含20％甘油的生理盐水，剥取肌纤维10根左右，放置0.5 ml Ep管底部，加入10 μl Gubstraub溶液，4℃过夜，离心后吸取上清液，蛋白定量后冷冻保存。

　　3． 肌球蛋白的部分纯化：基本按Konagaya等［6］方法进行。简言之，取正常人与MG患者肌肉各1块（约10 mm3），按上述常量提取法获得蛋白上清液， 该上清液以14倍体积的预冷无离子水稀释，混匀后10 000×g离心 10 min，沉淀用100 μl Gubstraub溶液溶解，再以9倍体积的预冷无离子水稀释，混匀后10 000×g离心10 min，沉淀用50 μl Gubstraub 溶液溶解。

　　4． 蛋白的单相电泳分析：基本按Laemmli［7］ 方法进行非连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。制胶及电泳缓冲液均为含 0.1％SDS的Tris/Gly, pH 8.3。常量电泳分析蛋白加样量均为30 μg,凝胶用考马斯亮蓝染色。微量电泳分析加样量均为1 μg, 蛋白检测基本按Kirkeby等［8］方法进行银染。

　　5． 蛋白双向电泳分析：基本按任惠民等［9］方法进行。第1向等电聚焦的胶长约40 mm，直径0.7 mm，凝胶浓度为5％（含4％ pH 3.5～10.0的ampholyte, 5%甘油和1％尿素）。蛋白加样量为30 μg，凝胶上蛋白用银染显色。

　　6． 蛋白分析及统计方法：将所需比较的蛋白谱带经生物电泳图像分析仪扫描并计算密度。检测结果以±s表示，两组间比较采用t检验。

　　结果

　　1． 肌肉蛋白的微量和常量分析电泳图谱：图1左侧为常量提取的肌肉蛋白电泳图谱，图1右侧为微量提取的肌纤维蛋白经电泳分离的银染图谱。2种方法分析的结果均显示，相对分子质量约25 000蛋白谱带浓度在正常肌肉中明显高于MG肌肉。

　　2． 正常人肌肉与MG患者肌肉25 000蛋白水平的比较：常量电泳分析，25 000蛋白谱带经扫描计算，密度在正常肌肉中为4.14±1.33， MG肌肉中

　　3． 蛋白的双向电泳图谱：图2A为正常人及MG患者肌肉蛋白的双向电泳图谱。从图2A可看出单相SDS-PAGE图谱所显示的25 000谱带至少由2个蛋白成分组成，正常肌肉与MG肌肉中有明显差异的是1个偏碱的蛋白成分。图2B为提取的肌肉蛋白与部分纯化的肌球蛋白提取物双向电泳图谱。可以看出，有差异的25 000蛋白与肌球蛋白提取物获得的蛋白成分无关。

　　讨论

　　人们很早就对MG患者肌肉的形态学特征及与肌肉收缩有关的重要化学物质，如肌球蛋白、肌动蛋白等进行了研究。虽然发现MG患者血清中抗肌球蛋白、肌动蛋白、肌钙蛋白等抗体滴度高于健康人［10］, 但迄今仍没有充分的证据说明MG患者肌细胞中调控肌纤维收缩的粗丝、细丝和Z带等形态学特征以及与肌肉收缩有关的蛋白合成发生了明显的改变，即使是在MG患者胸腺组织，也未发现肌样细胞(myoid cells)的数目和结构以及对肌球蛋白、肌钙蛋白等抗体的染色反应与正常人有明显的差别［11］。因此，目前对MG的研究主要集中在对AChR的结构、抗体与抗原免疫学特征、应答AChR功能丧失的免疫学机制等方面。那么，MG患者肌细胞内的化学物质，特别是DNA与

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