重症肌无力患者骨骼肌肌肉蛋白成分分析

　　【Key words】　Myasthenia gravis； Muscle, skeletal； Proteins

　　重症肌无力（MG）被认为是一种由乙酰胆碱受体（AChR）抗体引起神经肌肉接头突触膜AChR功能丧失的自身免疫疾病。但近年已发现，一系列的非AChR骨骼肌抗体［1］、Ryanodine 受体抗体及补体C9等均与MG的发病有关［2］。最近，我们不仅从肌肉组织中筛选到5个在正常人和MG患者肌肉中表达有明显不同的新的基因片段［3］，而且发现在以PBS提取的MG患者肌肉蛋白成分中，1个相对分子质量约25 000的蛋白的水平明显低于正常人肌肉。由于AChR 抗体阳性和阴性的MG患者临床表现相似，均为骨骼肌极易疲劳，并且已经知道Duchenne和强直性等肌营养不良的肌病患者骨骼肌肌球蛋白轻链组成发生了改变［4］，那么，是否MG患者肌肉极易疲劳的唯一原因为AChR功能的丧失， 而不涉及肌肉蛋白，特别是与收缩有关的蛋白的变化呢？本研究就此问题进行探讨。

　　资料和方法

　　1． 样品来源：正常人肌肉标本10份，取于10例骨折手术病人的肢体骨骼肌。MG患者肌肉标本17份，取于17例全身型MG患者，无呼吸肌受累，其中8例伴胸腺瘤，9例伴胸腺增生。肌肉取自MG患者胸腺切除手术切口周围的骨骼肌，标本均于-27℃保存。

　　2． 蛋白的提取及浓度的测定：蛋白按常量及微量两种方法进行提取。常量提取：肌肉样品取米粒大小置微量玻璃匀浆器，加入100 μl肌球蛋白提
取液Gubstraub溶液(0.3 mol/L KCl，0.10 mol/L KH2PO4，0.05 mol/L K2HPO4,pH 6.5)，冰浴下制成匀浆，吸出肌肉匀浆，加50 μl提取液洗涤，合并匀浆液并放置4℃过夜，10 000×g离心15 min，上清液再经25 000×g离心10 min，按Spector［5］方法测定蛋白浓度。微量提取：将低温贮存的肌肉标本移至4℃冰箱，放置片刻使其软化，取一小块肌肉置解剖镜下滴加含20％甘油的生理盐水，剥取肌纤维10根左右，放置0.5 ml Ep管底部，加入10 μl Gubstraub溶液，4℃过夜，离心后吸取上清液，蛋白定量后冷冻保存。

　　3． 肌球蛋白的部分纯化：基本按Konagaya等［6］方法进行。简言之，取正常人与MG患者肌肉各1块（约10 mm3），按上述常量提取法获得蛋白上清液， 该上清液以14倍体积的预冷无离子水稀释，混匀后10 000×g离心 10 min，沉淀用100 μl Gubstraub溶液溶解，再以9倍体积的预冷无离子水稀释，混匀后10 000×g离心10 min，沉淀用50 μl Gubstraub 溶液溶解。

　　4． 蛋白的单相电泳分析：基本按Laemmli［7］ 方法进行非连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。制胶及电泳缓冲液均为含 0.1％SDS的Tris/Gly, pH 8.3。常量电泳分析蛋白加样量均为30 μg,凝胶用考马斯亮蓝染色。微量电泳分析加样量均为1 μg, 蛋白检测基本按Kirkeby等［8］方法进行银染。

　　5． 蛋白双向电泳分析：基本按任惠民等［9］方法进行。第1向等电聚焦的胶长约40 mm，直径0.7 mm，凝胶浓度为5％（含4％ pH 3.5～10.0的ampholyte, 5%甘油和1％尿素）。蛋白加样量为30 μg，凝胶上蛋白用银染显色。

　　6． 蛋白分析及统计方法：将所需比较的蛋白谱带经生物电泳图像分析仪扫描并计算密度。检测结果以±s表示，两组间比较采用t检验。

　　结果

　　1． 肌肉蛋白的微量和常量分析电泳图谱：图1左侧为常量提取的肌肉蛋白电泳图谱，图1右侧为微量提取的肌纤维蛋白经电泳分离的银染图谱。2种方法分析的结果均显示，相对分子质量约25 000蛋白谱带浓度在正常肌肉中明显高于MG肌肉。

　　2． 正常人肌肉与MG患者肌肉25 000蛋白水平的比较：常量电泳分析，25 000蛋白谱带经扫描计算，密度在正常肌肉中为4.14±1.33， MG肌肉中为2.02±1.08, 差异有非常显著意义(P＜0.001)。微量电泳分析，25 000蛋白谱带密度在正常肌肉中为4.26±2.58, MG肌肉中为1.32±0.79,差异亦有非常显著意义(P＜0.001)。

　　3． 蛋白的双向电泳图谱：图2A为正常人及MG患者肌肉蛋白的双向电泳图谱。从图2A可看出

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