胰岛素抵抗细胞模型的胰岛素降解酶表达

　　【Key words】　Chloroquine; Insulysin; Gene expression ; Insulin resistance; Hepatocyt

　　胰岛素降解酶(IDE)活性升高致胰岛素降解过快与胰岛素抵抗(IR) 的发生有关，IDE抑制剂可改善胰岛素敏感性〔1，2〕。本研究以大鼠原代肝细胞IR 模型为研究对象，研究IDE基因表达与胰岛素敏感性的关系，并探讨IDE抑制剂氯喹改善IR的 机制。

　　材料和方法

　　一、原代大鼠肝细胞IR模型的建立

　　采用高浓度胰岛素诱导培养法复制Wistar大鼠原代肝细胞的IR模型〔3〕，本研究将 在含5×10-7 mol/L胰岛素的培养液中孵育16 h的细胞为IR细胞，在不含胰岛素的培 养 液中孵育16 h的细胞为对照细胞，未经16 h孵育的细胞为空白细胞。

　　二、原代大鼠肝细胞的IDE活性测定

　　采用放射酶分析法测定，按文献操作〔4〕。

　　三、原代大鼠肝细胞的胰岛素敏感性测定

　　采用14C-2-　脱氧葡萄糖　(14C-2-DG)　掺入率和14C-醋酸盐掺入率评 价大鼠肝细胞的胰岛素敏感性〔5，6〕。14C-2-DG和14C-醋酸盐均 购自Sigma。

　　四、原代大鼠肝细胞胰岛素降解酶基因(EIG)的表达

　　采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)〔7〕检测EIG水平。原代大鼠肝细胞经16 h培 养后，于室温向培养板中加入Tripure试剂(Boeheringer Mann-heim产品)使细胞裂解后， 按说明书提取细胞总RNA。IDE基因引物根据大鼠IDE基因的cDNA序列〔8〕设计，扩 增 片 段300 bp，引物序列为：上游引物P1 5 -AATGATACTCTCTGCAGA-3 ，下游引物P2 5 -GT TTGAATCACCTGAGTC-3 。内标准物为β-a
ctin，采用文献的引物序列，扩增片段270 bp ，其序列为：上游引物P3 5 -AAATCGTCGGTGACATCAAA-3 ，下游引物P4 5 -ATCGTACTCGTG CTTGCTGA-3 。两对引物均由上海生工生物公司合成。cDNA第一链合成使用MBI Fermentas RT-PCR试剂盒。cDNA第一链合成结束后，用PCR扩增cDNA第一链，反应条件为：94℃ 5 min 后，进行40个循环扩增(94℃,1 min；55℃，45 s；72℃，90 s)。再经72℃ 10 min、4℃ 5 min后，即可进行扩增产物鉴定。凝胶用凝胶成像分析系统紫外光成像，并经专用图形分析 软件测出各条区带光密度值，结果以IDE区带的光密度值积分/β-actin区带的光密度值积 分表示。

　　五、大鼠肝细胞IDE酶蛋白(EIP)的表达

　　采用免疫印迹技术检测〔7〕。用Tripure试剂盒从细胞裂解物中提取RNA的同时提取 蛋白质。蛋白样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，剥离凝胶，150 V半干式电转移30～45 m in。电转移结束后，向NC膜上依次加入抗大鼠IDE多克隆抗体(1抗，工作浓度1:100，德国Sc hnide教授惠赠)和HRP标记的兔抗小鼠IgG(2抗，工作浓度1:1　　000，北京中 山生物技术公司 )孵育，DAB显色液显色。NC膜经凝胶成像分析系统可见光成像后，图像用图形分析软件测出 各条区带的光密度值。

　　六、氯喹对原代大鼠肝细胞的IR形成过程中EIG及EIP水平的影响

　　A1细胞：在加入1 mg/ml氯喹的含5×10-7 mol/L胰岛素的培养液中经16 h孵育的大鼠 肝细胞。A2细胞：在加入1 mg/ml氯喹的不含胰岛素的培养液中经16 h孵育的大鼠肝细胞。

　　孵育结束后，检测EIG和EIP水平。

　　七、氯喹对原代大鼠肝细胞的IR模型的EIG及EIP水平的影响

　　B1细胞：在含5×10-7 mol/L胰岛素的培养液中孵育16 h后，继续在含有1 mg/ml氯喹 但不含胰岛素的培养液中孵育2 h的原代大鼠肝细胞。B2细胞：在不含胰岛素的培养液中孵 育16 h后，继续在含有1 mg/ml氯喹但不含胰岛素的培养液中孵育2 h的原代大鼠肝细胞。

　　孵育结束后，检测EIG及EIP水平。

　　八、统计学处理

　　EIG、

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