糖尿病大鼠外周血淋巴细胞及胰腺 细胞凋亡初步观察

　　细胞凋亡(apoptosis)是近年来免疫学、细胞分子生物 学及临床医学研究的热点。正常的细胞凋亡过程是生命活动的组成部分，而细胞凋亡过早过 多 或过迟过少与多种疾病的发生有关。目前随着对糖尿病研究的深入，业已发现胰岛细胞的凋 亡对1型糖尿病的发生和发展起着重要作用，对2型糖尿病的作用尚无定论。此外，细胞凋亡 异常对糖尿病慢性血管并发症的发生也起一定的作用。我们对糖尿病大鼠外周血淋巴细胞和 胰腺细胞的凋亡以及胰岛素对二种细胞凋亡的影响进行了研究，旨在了解糖尿病大鼠外周血 淋巴细胞及胰腺细胞的凋亡情况以及胰岛素治疗是否具有抑制细胞凋亡的作用。

　　一、材料与方法

　　1.动物模型的建立：选体重250克左右的雄性Wistar大鼠18只。其中12　只以链脲佐 菌素　(STZ)60 mg/kg〔溶于0.1 mmol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)，STZ浓度为1%〕一 次腹腔内注射，48小时后用ONE TOUCH Ⅱ型血糖仪测定鼠尾静脉全血血糖，当血糖≥13.9 m mo l/L时定为糖尿病；其余6只大鼠注射相同体积的柠檬酸钠缓冲液，作为正常对照组(N组)。1 2只糖 尿病大鼠分成糖尿病组(D组)和胰岛素治疗组(Ⅰ组)各6只，每组自由进食及进水，D组保持 血糖在较高水平；Ⅰ组根据血糖水平腹腔内注射鱼精蛋白锌胰岛素(PZI)2～3 U/d，控 制任意血糖至11.1 mmol/L左右。4周后取血及胰腺组织进行各项检测。

　　2.方法：(1)用ONE TOUCH Ⅱ型血糖仪分别测定三组大鼠静脉血实验前后的任意血糖。(2)取 大鼠心脏内血液3 ml，置于无菌肝素抗凝管内，以淋巴细 胞分离液从新鲜血中分离淋巴细胞 ，经PBS洗涤后，用含10%人AB型血清的RPMI1640培养液将细胞调至1.5×106/ml。将待 检 的淋巴细胞置于37℃ 5%的CO2培养24小时，吸取细胞用DNA断端标记法(TDT)标记。(3)无 菌状态下取大鼠胰尾部分(经Mallory三色染色法在光镜下证实胰尾部含较多胰岛细胞〔 1〕)，置于含2%新生小牛血清(NBS)的生理盐水中制成细胞悬液，96目尼龙网过滤、洗涤 。将细胞调成1×106/ml，于含10% NBS的DMEM培养液中，　　37℃ 5%的CO 2孵育24小时，取出进行Tunel法染色 ，观察胰岛细胞凋亡。(4)参照Gorczyca等〔2〕方法，略加改良，将细胞沉淀加入含 1%甲醛的PBS 1 ml，4℃ 30分钟，洗涤二次，加入0.5 μg末端转移酶，0.5 nmol/L生物素 -16-dUTP，37℃ 3小时后取出，PBS洗涤后加入生物素标记的异硫氰基萤光素(FITC)，室 温30分钟，PBS洗涤 ，发生凋亡的细胞DNA出现断裂，可被dUTP标记在流式细胞仪及荧光显微镜下呈荧光阳性。( 5)将待检 的胰腺组织置于10% NBS RPMI1640中制成细胞悬液，加0.5 mg/ml RNAase消化，37℃ 30分 钟碘化丙啶(PI)染色，流式细胞仪检测计算G0/G1期之前的A0峰，以峰值面值计算凋 亡量。(6)荧光显微镜下的细胞凋亡形态：早期凋亡荧光染色呈环形；中期凋亡呈斑块形与 新月小体形；晚期凋亡 的细胞体积缩小，呈一极亮的荧光团，或表现为凋亡小体聚集的形式〔3〕。

　　3.统计学处理：所有实验数据均以±s表示，组间差异用t检验。

　　二、结果

　　1.三组大鼠血糖的变化：实验前、后N组大鼠血糖分别为(2.76±0.38)mmol/L和(2.95±0.36 )mmol/L，D组分别为(17.28±2.70)mmol/L和(16.50±3.05)mmol/L，均显著高于正常组([ HT P＜0.001)。I组糖尿病大鼠经胰岛素治疗后，血糖由(1 7.35±2.9)mmol/L降至(12.42±1.82)mmol/L，治疗前后血糖浓度差异有显著性(P＜0.05)。

　　2.荧光显微镜下大鼠外周血淋巴细胞的凋亡形态显示，D组呈典型的凋亡图像，呈荧光浓染 。I组中也可见较多的凋亡小体。而N组仅见少量的细胞凋亡。

　　3.流式细胞仪测定大鼠外周血淋巴细胞和胰腺β细胞的凋亡率。

　　D组外周血淋巴细胞的凋亡率(40.15±10.70)明显高于N组(17.70±3.92)与I组( 27.00±4.44)　　(P　值分别　 ＜0.01及＜0.05)；N组与I　组相比差异亦有显著　性(P＜0.01)。胰岛细胞凋亡的观察结果则表明 ：D组大鼠胰腺中发生凋亡的细胞明显增多(35.33±4.59)，与N组(23.00±2.90)及I组(23. 33±7.12)之间差异均有显著性(P值均＜0.01

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