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原代培养人胎肝细胞体外感染HBV的研究 |
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养液0．5mL(即每孔含细胞数为2x105个)，每24h更换培养液．培养48h后，于培养液中加入HBV感染血清(终体积分数为10％)，并在培养液中加入40g／L聚乙二醇(PEG)．37°C培养16h(过夜)后，弃去上清液，细胞用RPMl1640培养液洗涤3次后(最后一次洗涤液留样待检)，加入含100mL／LFIBS和20g／二甲基亚枫(DMSO)的新鲜RPMl1640培养液(不含PEG)．每48h更换培养液(培养液组成同前)．每48h收集上清液和肝细胞。实验分为HBV感染组和空白对照组(无HBV感染)．培养人胎肝细胞于培养后每隔2d以倒置生物相差显微镜观察细胞形态变化过程及贴壁生长情况．培养上清液中HBsAg检测采用ELISA法，细胞中HBsAg检测采用免疫组化SP法，细胞中HBVDNA检测采用原位杂交法．培养上清液中HBVDNA检测采用斑点杂交法．同时设阳性对照、阴性对照、空白对照和替代对照。2结果2．1培养人胎肝细胞形态的动态变化实验前(即培养后48h)人胎肝细胞生长良好，肝细胞体积大，形态为扁平不规则多角形，细胞核清晰可见，肝细胞增殖活跃，基本铺满培养板孔底。实验组和对照组人胎肝细胞在培养后22d一直维持正常的形态结构，自培养后14d开始，人胎肝细胞逐渐死亡，脱落于培养液中。2．2HBV在人胎肝细胞中稳定复制留存洗涤液中HBsAg呈阴性，感染后所有留存系列上清液中HBsAg均呈阳性，HBsAg在感染后2d～20d均可测出，以4d～16d达高峰(图1)．免疫组化检测细胞中HBsAg呈阳性表达(图2)，空白对照组呈阴性表达．原位杂交HBVDNA呈阳性表达．上清中HBVDNA斑点杂交也呈阳性表达(图3)。图1培养上清中HBsAg含量图2HBV感染人胎肝细胞中HBsAg表达(S-P400)图3上清中HBVDNA呈阳性表达(斑点杂交法)3讨论由于乙型病毒性肝炎(HB)及其相关疾病的复杂性，对该病的多数研究必须借助体外实验进行。事实上，目前获得的有关HBV感染及复制机制、HBV基因调控、基因产物的功能等均得益于HBV基因转移或转染细胞株．但有关研究尚存在许多不足，如细胞株不能完全模拟人体内肝细胞的生物学功能，用于研究HBV与肝细
胞相互作用时，不能真实反映体内情况．用人胎肝细胞作为感染对象，建立HBV感染的人胎肝细胞体外培养系统，可解决上述不足，要建立HBV感染人胎肝细胞体外培养系统，必须满足三个基本条件：①肝细胞体外培养达20d以上；②肝细胞维持良好的增殖和分化功能；③HBV能在人胎肝细胞中稳定复制表达．肝细胞在体内受到来自门静脉血流的各种激素和细胞因子的调控，其中包括表皮生长因子、肝细胞生长因子、生长激素等，这些称为门脉嗜肝因子，能够促进和维持肝细胞的增殖和分化，有学者据此设计了一种条件培养液，添加各种激素、细胞因子和微量元素，称为激素限量培养液(hormonedefinedmedium，HDM)，模拟肝细胞生长的环境，能够使原代培养的肝细胞维持良好的分化和增殖功能达50d以上．HBV体外感染肝细胞培养系统的建立，国外报道较多[3,4]，国内少见报道。我们在培养液加入PEG以利HBV进入肝细胞，并在培养液中加入DMSO以促进HBsAg的表达，研究发现，感染后2d～20d培养上清中可检出HBsAg，4d～16d达高峰，以后HBsAg分泌逐渐下降，分析其可能原因：培养早期细胞增殖较快，因细胞有接触抑制特性，细胞增殖到一定程度，增殖速度变慢，最后完全停止增殖，维持一定时间后，细胞开始死亡、脱落．我们认为HBV在人胎肝细胞中能稳定复制表达，其根据：①留存洗涤液标本中HBsAg呈阴性，斑点杂交示HBVDNA也呈阴性，基本排除感染血清残留对实验造成的干扰；②细胞中HBsAg和HBVDNA均呈阳性，说明HBV已进入肝细胞；③由于每隔48h再换培养液，系列培养上清中HBsAg和HBVDNA均呈阳性，且维持较前相同或稍高水平，有一分泌高峰，说明HBV及其表达的抗原持续分泌至培养液中。HBV感染人胎肝细胞培养系统的建立虽是一初步研究，但却为HBV相关疾病的研究奠定了基础。 基金项目：国家自然科学基金资助项目，No-39570166 作者简介：蒋业贵，男，1966年12月25日出生，安徽省巢湖市人，汉族，1996年第三军医大学硕土，1999年第三军医大学博士，医师，主要从事病毒性肝炎的研究，发表论文10篇。 参考文献： ［1］Wang YM, Chen GZ, Dong JH, Yuan LP,Ding J.A metlvod of isolating hepatolytes.in uitro.Zahonghua Xiaohua Zazhi,1994;14:175 上一页 [1] [2] [3] 下一页
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