凋亡细胞促进狼疮性BXSB小鼠发病的研究

　　1　材料与方法

　　1.1　实验动物：4周龄C57小鼠，购自中国科学院遗传学研究所；4周龄雄性和雌性BXSB小鼠，由北京医科大学第三临床医学院皮肤科陈学荣教授自美国Jackson实验室引进，本室饲养繁殖。

　　1.2　凋亡细胞的诱导及收集：取同基因同性别的4周龄小鼠的胸腺细胞，用含10%FCS(hyclone)的RPMI-1640培养液配成1×107/ml浓度，加地塞米松(Dex)至10－5 mol/L浓度，在37 ℃，5%CO2的条件下，诱导细胞凋亡24 h。然后，收集胸腺细胞，用RPMI-1640培养液洗涤3次。经PI染色，用流式细胞仪检测亚二倍体细胞数作为胸腺凋亡细胞的数量。

　　1.3　免疫过程：分别将4周龄C57小鼠和雌雄BXSB小鼠随机分成两组，即实验组和对照组，每组5只小鼠。实验组每只小鼠经腹腔注射0.2 ml体积的含5×107同性别同基因的凋亡胸腺细胞。每隔10 d注射1次，共注射免疫3次。对照组每只小鼠经腹腔注射0.2 ml体积的RPMI-1640培养液，注射的次数及间隔时间同实验组。

　　1.4　免疫学检测：末次注射的10 d后，留取实验组和对照组小鼠的血清、尿液和肾脏。

　　血清作1∶50稀释，用ELISA法检测IgM和IgG类型的抗ssDNA和抗dsDNA抗体，其浓度以ELISA底物显色的A值示之。

　　用考马斯亮兰G-250液测定尿液中尿蛋白浓度［6］，作为肾炎有无或程度的指标。

　　用二乙酰单肟法测定血清中尿素氮(BUN)的浓度，作为肾功能状态的指标。试剂盒购自北京北化精细化学品公司临床诊断试剂分厂，实验方法按说明书进行。

　　留取的肾脏经冰冻切片后，用免疫荧光法［7］检测肾脏有无IgG类型免疫复合物(IC)的沉积。

　　2　结　　　果

　
　2.1　IgM类型抗DNA抗体的水平：胸腺细胞经10－5 mol/L Dex诱导24 h后，PI染色，用FACS检测，发现约83%细胞是亚二倍体的凋亡细胞。各个实验组小鼠与相应的对照组小鼠血清中IgM类型的抗dsDNA和抗ssDNA抗体水平差异无显著性(P＞0.05)。并且，正常C57小鼠和雌雄BXSB小鼠的血清中IgM类型的抗dsDNA和抗ssDNA抗体水平相似。

　　2.2　凋亡细胞诱导IgG类型抗DNA抗体的产生：在实验组的正常C57小鼠和雌性BXSB小鼠的血清中，IgG类型的抗dsDNA和抗ssDNA抗体水平非常显著地高于各对照组小鼠(P＜0.001)。但是，实验组雌性BXSB小鼠与对照组雌性BXSB小鼠相比，前者血清中IgG类型的抗dsDNA和抗ssDNA抗体的平均水平(A值)比后者分别增加了1.593和2.051 3；而实验组C57小鼠与对照组C57小鼠相比，前者的血清中IgG类型的抗dsDNA和抗ssDNA抗体的平均水平(A值)比后者分别增加0.685和0.898 4。显然，实验组雌性BXSB小鼠血清中IgG类型抗DNA抗体水平增加的幅度高于实验组C57小鼠。

　　此外，虽然实验组雄性BXSB小鼠血清中IgG类型的抗dsDNA和抗ssDNA抗体的平均水平高于其对照组小鼠，但增加的幅度并无显著性。

　　2.3　凋亡细胞加重雄性BXSB小鼠的狼疮肾炎：正常C57小鼠的实验组和对照组以及雌性BXSB小鼠的实验组和对照组之间尿蛋白浓度差异无显著性(P＞0.05)，并且都处于正常范围内。所有雄性BXSB小鼠的尿蛋白浓度均已高于正常范围，表明肾脏出现炎症反应。但是，雄性BXSB小鼠实验组的尿蛋白浓度比对照组的显著升高(P＜0.05)，提示凋亡胸腺细胞进一步加重了实验组雄性BXSB小鼠的肾炎病变程度。

　　免疫荧光法检测的结果显示，C57小鼠与雌性BXSB小鼠的实验组和对照组的肾脏均无IgG型IC的沉积。而雄性BXSB小鼠的实验组和对照组的肾脏均有IgG型IC的沉积。但是，由于方法的限制，未对两组小鼠肾脏IC的沉积程度作精确定量性的鉴定和区分。

　　无论是正常C57小鼠还是狼疮遗传倾向的雌雄BXSB小鼠，实验组和对照组小鼠之间的血清BUN水平差异无显著性(P＞0.05)，并且都处于正常范围内。表明凋亡细胞在诱导抗DNA抗体产生的体液免疫应答过程中，虽然加重了雄性BXSB小鼠的肾炎病变程度，但还没有达到引起肾脏功能衰竭的程度

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