嗜酸细胞凋亡在激素抵抗型哮喘中的意义

　　对象与方法

　　一、对象

　　哮喘患者45例，均符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制订的诊断标准［2］。所有患者基础一秒钟用力呼气容积占预计值百分比（FEV1占预计值％）≤75％，支气管舒张试验阳性（FEV1占预计值％改善≥15％）。受试者无严重心、肝、肾疾患及恶性肿瘤，受试前1个月未使用免疫调节剂或细胞毒药物。其中SS 30例，SR 15例，标准：口服泼尼松20 mg/d 1周，FEV1占预计值％改善≥25％为激素敏感型，≤15％为激素抵抗型。

　　二、设备和试剂

　　紫外分光光度仪（U-3400，日本日立公司）、751 GW型分光光度仪、酶标仪、流式细胞检测仪（Coulter Elitee ESP，法国）。人IL-5酶联免疫(ELISA)试剂盒，人GM-CSFELISA试剂盒（ENDOGEN，美国）、FITC标记抗CD95，碘化丙啶（PI）染液（美国Sigma公司，工作液50 μg/ml），细胞固定-打孔试剂盒（IntraPrepTM Permeabilization Reagent，法国Coulter公司）。

　　三、方法

　　1.外周血单个核细胞（PBMC）与嗜酸细胞的分离和制备：停用泼尼松2周以后，采取外周静脉血20 ml，肝素抗凝，等体积Hank液稀释、混匀，用淋巴细胞分离液（深圳华美公司分装）分离获取PBMC，用Hank液洗涤2次，调整细胞浓度为1×106/ml。取管底颗粒细胞重悬于相对密度为1.070含10％小牛血清的percoll液。制备4个不同密度的percoll液，密度

　　2.PBMC体外培养及细胞因子检测：PBMC以无血清RPMI 1640培养液洗涤，制成细胞悬液，置96孔培养板，每份2孔，每孔细胞数1×105 ml，加入植物血凝素（PHA）终浓度为50 mg/L，其中1孔加入地塞米松（DXM，美国Sigma公司），终浓度为10-6mol/L，孵育24 h（37 ℃，5％ CO2），吸取上液，以IL-5、GM-CSF ELISA试剂盒测定IL-5和GM-CSF浓度。

　　3.EOS体外培养：EOS以无血清RPMI 1640液洗涤。制成细胞悬液，加入96孔培养板中，细胞浓度为每孔104 ml，每一受试者分为3孔，其中2孔分别加入：（1）DXM，终浓度为10-6mol/L；（2）DXM（10-6mol/L）+同一受试者PBMC培养上液10 μl。体外孵育72 h（条件同上）。

　　4.EOS凋亡率与Fas抗原检测：取70 μ孔径尼龙筛网过滤孵育EOS，滤过液低速离心1 000 r/min，3 min，去上清；调整细胞浓度为104/ml，加入CD95-FITC10U，按操作程序在室温避光孵育15 min后，加入5 ml PBS缓冲液离心洗涤，去上清。细胞固定打孔；经以上步骤处理的细胞转入流式上机试管，加入1 ml PI工作液作DNA染色，15 min后上机检测；由流式细胞仪专用数据分析软件（Elitee）进行数据处理。凋亡细胞与CD95（Fas）阳性细胞分别以占总细胞数的百分数表示。

　　统计学处理：所有数据采用±s表示，用SPSS软件进行t检验分析。

　　结果

　　一、 SS组与SR组哮喘患者PBMC产生细胞因子水平的差异

　　我们的试验显示，哮喘患者PBMC可在体外培养时分泌两种主要的促炎症细胞因子IL-5和GM-CSF，其基础分泌水平SR组较SS组患者略高，但二者比较差异无显著性（P＞0.05）。预先在培养液中加入DXM，对SR组患者的PBMC产生细胞因子有轻度影响，与基础水平比较差异无显著性（P＞0.05），但可显著地使SS组PBMC产生的细胞因子浓度明显下降，提示激素抑制PBMC的作用在SS型哮喘较SR型哮喘敏感（表1）。

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