结核病分子流行病学的概况和进展

　　对于涂阴病例的传播，过去有人认为微不足道，但涂阴并非菌阴，包括涂阴培阳，既有培养物则可作DNA指纹分析，一篇结果证明涂阴培阳传播者占17%［8］。

　　4.识别耐药菌感染流行。Moss等［9］对1992年纽约市26所医院的耐多药结核病患者的分离株作指纹检查，发现一种结核分支杆菌的W菌株，它同时耐4种一线药(异烟肼、利福平、乙胺乙醇、吡嗪酰胺)和卡那霉素，且与AIDS联系密切，82%W菌株患者都是HIV(＋)，如不作指纹分析，则无从识别。另有一相反的实例，Wilson等［10］(1999)在德克萨斯根据指纹图谱调查结果认为基于病例簇的百分率低和簇群狭小，在德克萨斯没有耐药结核病广泛传播的证据。

　　5.区别院内交叉感染和患者间重染。院内纤支镜等医疗器械所引起的交叉感染、患者间的交叉感染、夫妇间感染、同车间感染、大家庭大家族亲属间互相感染、近亲还是远亲传播，图谱相同的病例簇，结合发病期分析，可以判定谁先谁后。例如在法国一所2 250张床的大医院，对一年中住院结核患者140例作指纹检查后认为成簇的结核病并非院内传播，而是由于
社区传播，是在收容所和流动工人住所中传播所致［11］。

　　6.在菌株和菌种之间进行碱基替代的判断、菌种的鉴定，了解结核分支杆菌毒力与分子的关系，以及监测卡介苗的效果。Zhang等［12］用脉冲场凝胶电泳法(PFGE)观察限制性大片段(LRF)，能鉴定不同BCG菌株的基因差异及特异性亚型，有助于流行病学调查(流调)、监测卡介苗生产和卡介苗的效果。van Soolingen等［13］在BCG广泛应用的中国和突尼斯发现，结核分支杆菌基因型变化比未应用BCG的地区如荷兰和埃塞俄比亚为少，中国的邻国蒙古、韩国和泰国有类似的基因型变化小的情况，提示具有选择性优势的基因型进化，而产生一种假说：BCG的使用可能引起优势克隆的选择。还提出在东亚的结核分支杆菌中，有一种单遗传型占优势的北京家族(Beijing family)，曾在中国、蒙古、韩国和泰国出现，此家族祖先源于中国，绵延近一百年。华裔占泰国人口10%，大多数在20世纪上半叶从中国东南沿海诸省迁往泰国，泰国学者推论东南亚诸国有类似情况［14］，有待证实。

　　7.实验室质量控制［15］。临床实验室由于污染，常发生假阳性，聚合酶链反应(PCR)查痰菌假阳性率较高，BACTEC有少数假阳性，痰菌培养也有个别假阳性。临床提出疑问后，实验室应再作指纹分析，如果RFLP IS6110不出现图谱表明前次PCR为假阳性，有混合图谱者为有污染。

　　8.建立结核分支杆菌基因资料库。通过对不同区域的分离株进行DNA指纹分析，将会对全球、全国、全省、全地区范围的结核分支杆菌的相关性及传播关系进一步了解，从而针对性地制定控制政策，并建立基因资料库，例如澳大利亚、加拿大、美国、荷兰等已逐步建立了结核分支杆菌基因资料库，纳入结核病控制的整体规划中。

　　三、DNA指纹的基本方法——标准RFLP分析法

　　Embden等［16］(1993)推荐了标准的结核分支杆菌RFLP分析方法学，已在国际上得到广泛认同并采用。

　　1.步骤：(1) 提取结核分支杆菌染色体DNA：破壁、处理、离心收集DNA。(2) 限制性内切酶酶解DNA：内切酶能在DNA特殊序列位点切割寡核苷酸片段，产生多种可测量的片段。最常用的内切酶是PvuⅡ，其次是Bst EⅡ、BcⅡ、HaeⅢ、PstⅠ、Bam HI等，约10多种供选择。(3) 凝胶电泳分离DNA片段：不同长度的DNA片段在凝胶中得到分离，DNA的微小突变都可引起菌株间DNA切断位点不同，使寡核苷酸片段长度出现差异。(4) Southern印迹杂交：将凝胶上的DNA片段转移到固相滤膜与DNA探针杂交，探针与DNA谱带的重复片段结合，即可使靶DNA片段显影。显影法有放射自显影、溴乙锭染色荧光目测等，亲缘菌株将产生相似或相同的谱带特征。

　　目前多采用非同位素标记的地高辛作探针IS6110的标志物。关于PCR和任意引物PCR技术，由于快速、简便等优点，也被广泛应用。

　　2.其它DNA指纹技术：(1)PCR限制性酶图谱分析(PRA)，用于鉴别非结核分支杆菌。(2) 快速DNA指纹及混合连锁PCR，用以鉴别实验室交叉污染及误判，获取分离物后2 d内可出结果。(3) 随机扩增多态性DNA分析(RAPD)，用编码16S～23S rRNA基因分隔区进行PCR扩增，其鉴别力高于用整个基因组DNA作模板者。(4) 脉冲场凝胶电泳

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