分支杆菌鉴定方法的比较研究

刘金伟　匡铁吉　王金河　裴宁　宋萍　仲斌 2005-3-9 10:36:00 中华结核和呼吸感染 2000年第10期第23卷

　　比较了微菌落法、多重聚合酶链反应(PCR)法和传统法用于分支杆菌临床分离物菌种鉴定的效果，现报告如下。

　　材料与方法：试验菌株：(1) 标准菌株：结核分支杆菌H₃₇R_V、牛分支杆菌、鸟分支杆菌、胞内分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、瘰疬分支杆菌、偶然分支杆菌和耻垢分支杆菌标准株，均购自北京结核病胸部肿瘤研究所。(2) 临床分离株：来自我院结核病住院患者的痰、胸液和脑脊液。

　　传统分型鉴定试验：(1) 培养鉴定试验：按常规制备对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)培养基，取试验菌株菌悬液(10^-2/ml)0.1 ml接种，37 ℃培养，4周看结果。(2) 生化试验：68 ℃耐热过氧化氢酶试验、硝酸还原试验和吐温80水解试验，均按常规操作。

　　微菌落观察法：取试验菌株在37 ℃培养2～3周的斜面生长物，用无菌生理盐水配制相当于10^-3 mg湿菌/ml接种液，取0.1 ml接种匡氏琼脂平皿3个，涂匀后置36 ℃含5% CO₂的温箱培养3、7、12 d后分别在100倍显微镜下观察微菌形态，记录结果。

　　多重PCR鉴定法：多重PCR的三对引物是：MT₁和MT₂、PT₁和PT₂、IS₅和IS₆，它们分别扩增表达32 000蛋白的基因序列^［1］、MTP₄₀蛋白的基因序列^［2］和IS₆₁₁₀插入序列^［3］。DNA扩增采用的PCR仪为英国Techne公司产品，型号为GeneE，操作见参考文献［4］。

　　结果与讨论　三种菌种鉴定法用于分支杆菌鉴定所耗时间见表1。

表1　三种方法用于200株分支杆菌鉴别耗用时间比较

鉴别方法鉴别内容平均耗时(d)传统法结核、牛分支杆菌与非结核分支杆菌28微菌落观察法结核菌群与非结核分支杆菌7.8多重PCR法结核、牛分支杆菌与非结核分支杆菌2～3

表2　三种方法用于分支杆菌菌型鉴别的结果比较

方　法　　　受试菌株数正确鉴别菌株数%传统法20019396.5微菌落观察法20019497.0多重PCR法20019698.0

　　注：经χ²检验，三种方法鉴别正确率比较P＞0.05　　三种方法用于200株分支杆菌鉴定结果见表2。200株受试菌株中，有非结核分支杆菌11株，牛分支杆菌2株，其余187株均为结核分支杆菌，其中非结核分支杆菌株占5.5%。采用传统鉴定法，有4株结核分支杆菌株和2株非结核分支杆菌菌株鉴别不明确。微菌落法鉴别错误的有4株，其中2株由于平皿上有杂菌污染而错误地鉴定为非结核分支杆菌菌株。故在操作过程中严防杂菌污染，对提高微菌落法鉴定分支杆菌的准确率具有重要意义。多重PCR扩增分支杆菌DNA时产生1～3条带，其中引物MT₁-MT₂扩增一条500 bp的分支杆菌属特异DNA片段；引物IS₅-IS₆扩增一条1 000 bp长的结核分支杆菌菌群特异DNA带；引物PT₁-PT₂扩增一条约400 bp的结核分支杆菌种特异片段。扩增产物电泳后，结核分支杆菌DNA标本产生3条带，牛分支杆菌DNA标本产生2条带，非结核分支杆菌DNA标本产生1条带。影响多重PCR鉴定分支杆菌效果的主要因素是复性温度和Taq酶质量。多重PCR法复性温度为71 ℃，与延伸温度只差1 ℃，必须很准确。表1结果表明，采用传统法鉴定分支杆菌需28 d，与微菌落法和多重PCR法相比差异有非常显著性(P＜0.001)；微菌落法需7.8 d，与多重PCR法相比差异有显著性(P＜0.01)。三种方法相比，多重PCR法用于分支杆菌菌种鉴定所耗时间最短，

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