射苯巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，仰卧位固定。右股三角区纵行切口暴露股动脉及其分支，切开股动脉分支并逆行插入7F双球囊导管至髂动脉。经尾端注入0.5 mL空气充盈前囊，来回拖拉3次以剥脱血管内皮细胞。继之，后撤导管于股动脉处后，充盈双球囊以形成长约2.5 cm的无血流间腔。经导管侧孔用生理盐水冲洗间腔3次，注入0.25 mL约含3.0×109 pfu的Adex 1SR-lacZ入间腔，培养30 min。其间腔充盈压经压力传感器监测小于200 mmHg。随后，经导管侧孔回收病毒，生理盐水冲洗3次。松解球囊，撤除导管，结扎股动脉分支，恢复血流，缝合伤口。左侧股动脉依同法注入0.25 mL约含3.0×109 pfu的Adex1W入间腔，培养30 min。术毕，动物送动物中心饲养。术后常规抗生素治疗3天。双球囊导管法导基因入血管示意见图1。
图1 双球囊导管法导基因入血管示意图
3.组织化学分析 基因导入后24小时(n=2)和3、7、14、21、28及35天（n=3)，经静脉注入过量苯巴比妥钠处死动物，迅即取出双侧股动脉，并沿血管长轴用锐利眼科剪剪开股动脉。冷生理盐水冲洗血管3次后，置于2%甲醛+0.2%戊二醛/PBS(pH 7.4)液中于4℃固定6小时。继之，PBS冲洗5次，浸泡冲洗10分钟×3次。随后将血管置于5 mmol/L铁氰化钾+5 mmol/L亚铁氰化钾+1 mmol/L二氯化镁+1 mg/mL x-gal的PBS液中37℃培养5小时。
染色完毕后，血管经生理盐水冲洗3次，重新置于2%甲醛+0.2%戊二醛/PBS(pH 7.4)溶液中于4℃固定24小时以上。继之将血管沿横轴切成5 mm条片，石蜡包埋。使用组织切片机将包埋组织切成5 μm的切片，经核固红法(nuclear
fast red)染色后显微镜下观察。
结 果
由于本实验所用腺病毒携带有细菌lacZ基因，后者表达的蛋白产物β-半乳糖苷酶与底物x-gal发生化学反应后呈蓝色，故本实验极易观察到基因是否得到表达及基因表达的部位与范围。经双球囊导管侧孔(图1)注入0.3 mL约含3.0×109 pfu之重组腺病入剥脱内皮后股动脉，经组织化学分析发现，lacZ基因在血管内侧的表达面积近乎100%(图2B)，组织切片示lacZ基因表达的深度近血管中膜的2/3(图2C)。而导入对照腺病毒之血管未见蓝染(图2A)。
图2 双球囊导管法基因导入犬股动脉后组织化学分析结果
A.对照血管大体标本，×6； B.导基因后7天血管大体标本，
×8；C.图2B血管组织切片标本，×120.M：中膜；O：外膜
继之，我们观察了lacZ基因在血管中表达的时间曲线。20只犬分别于基因导入后24小时，3、7、14、21、28及35天处死动物，取出股动脉，经组织化学分析发现，导基因入血管24小时后即可见lacZ基因表达，3天后达峰值的75%，7天达高峰，后渐退并维持28天，35天后则消失。说明腺病毒介导性基因导入血管后其外源基因之表达呈一过性特点。
讨 论
心血管疾病的基因治疗是近年来心血管研究的热点之一。血管平滑肌细胞(VSMC)作为基因治疗的重要靶细胞倍受重视，其主要原因是它参与了疗效确切的冠状动脉腔内成形术(PTCA)后血管再狭窄的发生与发展［4］。导基因入血管，抑制VSMC的增殖与游走可能为PTCA术后再狭窄的治疗带来新的契机。迄今为止，高效率导基因入血管的研究报道甚少。因此，在体直接对动脉壁进行高效的基因转移，至今对各国学者仍是一个具有挑战性的研究课题［5］。
腺病毒载体具有高转染性，可转染增殖和非增殖细胞，且可携带大的基因片断，视为心血管系统基因转导和基因治疗的合理载体［6］。本研究使用双球囊导管法将重组腺病毒导入犬剥脱内皮后股动脉，经30分钟常规压力下培养，7天后的组织化学分析结果表明，lacZ基因在血管内侧的表达面积高达95%以上，其深度亦达血管中膜2/3以上(见图2B和图2C)。提示腺病毒载体转基因入在体血管具有高效性。
然而，因腺病毒载体不能整合入宿主细胞的染色体，其携带基因的表达具有一过性的特点［7］。本观察发现，腺病毒介导性基因导入血管后，其基因在血管中表达于第7天达高峰，此后渐退至4周左右消失。有关其消失的机制尚不十分清楚，多认为与宿主产生的免疫反应有关［8］。
值得指出的是，双球囊导管法基因
上一页 [1] [2] [3] 下一页
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 内科论文 >> 正文