实验性阿霉素心肌炎心肌肌钙蛋白 免疫组化研究

　　【Key words】　Cardiac troponin I Monoclonal antibody Myocarditis Diagnosis Immunohistochemistry

　　心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心肌肌钙蛋白复合体的一个亚单位，存在于心肌肌原纤维细肌丝上，参与心肌的兴奋-收缩偶联，是心肌细胞的结构蛋白。有研究表明，cTnI仅存在于心肌，是心肌细胞的独特标志［1］。在心肌损伤诊断中敏感性强、特异性高，较CPK，CK-MB佳［2～5］，现已广泛应用于急性心肌梗死(AMI)、不稳定型心绞痛(UA)、PTCA术后、心律失常射频消融术后、心脏以及非心脏手术后心肌损伤的评估和诊断。本文基于cTnI对心肌损伤的高度特异性、敏感性，用cTnI单克隆抗体对实验性心肌炎进行免疫组化研究，观察其在炎症心肌中的定位分布，初步探讨cTnI在心肌炎评估、诊断中的重要意义，为cTnI应用于心肌炎诊断提供重要实验和理论依据。

　　材料与方法

　　1.材料：苯甲基磺酰胺(PMSF)、DDT，Sigma产品；丙烯酰胺、双异丙烯酰胺，德国Mech产品；福氏不完全佐剂，Sigma产品；羊抗鼠IgG-HRP，北京军事医学科学院产品；SPA，Sigma产品；SP试剂盒，Maxiam产品；固相免疫cTnI定性检测试剂盒，PBM公司产品；动物人工呼吸机，浙江医科大学仪器厂；Olympus显微镜，日本制造；其他化学药品均为国产分析纯试剂。

　　2.方法

　　(1)cTnI的纯化与鉴定：采用李志梁等已建立的cTnI纯化方法［6］。取健康成人意外死亡6小时内的心脏，经匀浆、高盐溶解、无盐沉淀、高温去杂、硫酸铵盐析、DEAE-DE32柱状层析等步骤提取纯化人cTnI，纯化后的cTnI经分子量、紫外吸收光谱、免疫原性和氨基酸组分鉴定。

　　(2)抗cTnI单克隆抗体的制备：取50　μg cTnI加福氏完全佐剂、卡介苗乳化后注入Balb/c小鼠腹腔，此后每周用25　μg cTnI加不完全福氏佐剂注射，连续6次。取脾细胞与Sp/20骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞。间接ELISA法筛选阳性细胞株，经过反复克隆化获得到5株抗cTnI单克隆抗体细胞株，分别为1H9、3D2、1H12、3A7、3A11，以3D2为本实验免疫组化第一抗体。

　　(3)大鼠阿霉素心肌炎模型的制备［7］：体重200～300 g SD大鼠12只，雌雄不限。其中8只给予阿霉素3 mg/kg腹腔注射，隔日1次，共4次，总剂量12 mg/kg；4只腹腔注射生理盐水作为正常对照。两组动物饲养6周，每隔1周尾静脉采血测血清酶及cTnI。

　　3.取材和染色：6周后两组大鼠均经3%戊巴比妥钠麻醉，气管插管人工辅助呼吸，分离腹主动脉行腹主动脉插管，剪开右心耳，生理盐水充分灌注后用多聚甲醛在体灌注固定，取左室心肌进行石蜡包埋，组织切片(5　μm)。两组标本均行HE染色和免疫组化SP染色。HE染色法：经二甲苯及不同浓度的酒精脱水、洗涤、伊红染色及中性胶封闭。免疫组化SP染色：经二甲苯至水脱蜡水化，过氧化物酶阻断，加入抗cTnI单克隆抗体，4℃湿盒过夜，再加生物素标记的羊抗鼠Ig,加链霉亲和素-HRP显色、复染、中性胶封闭。

　　结　　果

　　1.进行实验的12只大鼠均存活至实验终点，经组织学鉴定：对照组心肌完全正常；心肌炎组心肌存在不同程度的变性、坏死及淋巴细胞浸润，符合心肌炎的病理改变。

　　2.心肌炎组大鼠第四周血清心肌酶及cTnI变化：(见下表)

心肌炎大鼠(n=8)第4周血清心肌酶及cTnI改变(单位)

　　注前前

　　注射后

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