胎鼠长骨培养模型用于雌激素衍生物抗骨质疏松活性初步筛选

　　【Key words】　Osteoporosis，　Estrogens, synthetic;　Osteoclast;　Chondrocytes

　　目前用于观察雌激素类抗骨质疏松症药物疗效所采用的动物模型基本有两类,即去卵巢动物模型和体外骨器官或骨细胞培养模型。为对抗骨质疏松症化合物进行初步药理活性筛选寻找快捷、方便又经济的工具方法，我们于1997年1月至1998年6月采用旋转悬浮式小鼠胚胎长骨体外培养模型观察雌酚酮、骨靶向新化合物四环素-哌嗪雌酚酮(XW630)及其衍生物四环素-(2-羧酸酯)-哌嗪雌酚酮(ZWI-1)对骨生长的影响作用。

　　材料与方法

　　一、实验动物

　　2～3月龄昆明种小鼠，雌鼠体重（30±5）g，雄鼠体重（35±5）g，由四川抗生素研究所动物中心提供。小鼠在温度（24±3）℃、湿度60%～70%条件下，自由摄水摄食。选择健康雌、雄鼠于22时按雌∶雄为2∶1的比例合笼，次日8时检查阴栓，查见阴栓即为交配，定为妊娠0天，妊娠第16天8时定为妊娠第16天。

　　二、方法

　　1.药品与主要试剂：XW630、ZWI-1和雌酚酮由华西医科大学药学院郑虎研究室提供。培养基BGJ、Hepes、胎牛血清（FBS）均购自Sigma公司（美国）。

　　2.主要设备：隔水式恒温培养箱（上海跃进医疗器械三厂），旋转装置〔由微型电动机、铝合金转盘与支架构成（成都方圆电子工程研究所）〕，超净工作台（蚌埠净化设备厂），Olympus解剖显微镜（日本），Olympus显微镜(日本)，组织切片机（AO,美国），THW-500型真彩色图像分析系统(四川联合大学图像研究所)。

　　3.组织培养及观察：培养基的配制：将培养基BGJ溶于高压灭菌的双蒸水中，加入3.5 g碳酸氢钠和5.1 g Hepes，定容至1 L，正压除菌过滤后分装于无菌瓶，贮存于4℃冰箱备用。临用前加入10%FBS、150 μg/ml维生素C、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，调节培养基的pH为7.2。实验分组：实验分为XW630组、ZWI-1组、雌酚酮组和正常对照组。除正常对照组外，其他3组给药浓度分为10-7mol/L、10-8mol/L和10-9mol /L。每组培养长骨6根，重复5次。培养方法：将16天孕龄的小鼠脱颈椎处死，取出子宫，放入盛有Hank s液的培养皿中，分离胚胎，剪取雌性胎鼠前肢，于解剖显微镜下剥离肌肉及软组织，游离出尺骨共300根，并转移到盛有BGJ培养基的培养皿中。用滴管将尺骨转入培养瓶，按实验分组加入待测药物，置旋转装置上，通入O2∶CO2∶N2比例为45%∶5%∶50%的混合气体，气流量1.5 L/min，于（37.5±0.5）℃旋转培养，转速为35 r/min。24 h后补充气体1次，每次通气1 min。

　　骨干及骨总长度的测量：将培养48 h的尺骨转移至培养皿中，在带游标标尺的解剖显微镜下测量其骨总长度及骨干长度。组织学观察：将培养48 h的骨组织在4%多聚甲醛磷酸缓冲液（pH 7.2）中固定后，用7%EDTA磷酸缓冲液（pH 7.2，4℃）脱钙，其间每天更换EDTA磷酸缓冲液1次，16天后，将骨组织用双蒸水漂洗，逐级酒精脱水，石蜡包埋，纵切成5 μm厚切片，HE染色，二甲苯透明，封片。显微镜下对破骨细胞及肥大软骨细胞进行计数。

　　三、统计学方法

　　所得数据用均数±标准差(±s)表示,并进行方差分析和q检验。

　　结　果

　　解剖显微镜下可见长骨清晰地分为软骨区和骨化区。由HE染色切片可见软骨区分为静止区、增殖区和肥大区。骨干可见间质细胞，肥大区软骨细胞出现去分化迹象，间质组织之间可见许多腔隙及少量破骨细胞。各实验组骨干、骨总长测量结果及破骨细胞、肥大软骨

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